穹窿切断对大鼠下丘脑室旁核CRH、AVP表达的影响

发布时间：2018-05-02 20:24

  本文选题：弯窿切断 + PVN　； 参考：《中国医科大学》2007年硕士论文

【摘要】： 目的 促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)和精氨酸加压素(arginine vasopressin,AVP)对于促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)的合成和分泌是两种主要的调节肽。CRH和AVP在人类和啮齿类存在于下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)。这两种肽位于正中隆起神经终末相同的分泌颗粒中，共同释放入垂体门脉系统后，对腺垂体ACTH的分泌产生协同效应。CRH和AVP调节系统可能帮助机体处理各种应激事件。应激反应的主要特征是以下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamic-pituitaryadrenocortical axis，HPA轴)激活为核心的生理和心理反应。应激后CRH在HPA轴中发挥重要作用，控制着HPA轴的兴奋水平。AVP能增加CRH对ACTH分泌释放的调节作用。海马不仅是应激损伤的敏感区，而且还是HPA轴应激反应的高位反馈调节中枢。但是对于海马如何调节下丘脑的机制还不十分清楚，本研究通过大鼠穹窿切断模型，观察穹窿切断对大鼠下丘脑室旁核CRH和AVP表达的影响，探讨海马对HPA轴的抑制作用是否通过穹窿介导，为研究海马调节下丘脑的机制提供理论和形态学依据。 实验方法 1、实验动物及分组 成年健康雄性Wistar大鼠90只(由中国医科大学实验动物中心提供)，随机分为穹窿切断0天、4天、7天、10天组及相应的假手术组(只进行手术切口，未切断穹窿)和正常组，每组10只。 2、建立大鼠穹窿切断模型 大鼠经2％戊巴比妥钠麻醉后，，固定于脑立体定位仪(江湾IC型)，常规消毒，暴露出颅骨，于前囟后1.5mm，中线外左右各1.0mm处，用电动开颅器钻开颅骨，用自制双刃刀置于脑表面，接着降刀6mm(切断穹窿)，假手术组降刀2mm(未切断穹窿)，刀在脑中停留5min。手术实施后在安静条件下常规饲养，抗生素抗感染。 3、模型鉴定 采用Karnovsky法染色显示海马CA1区胆碱能神经纤维，每组每例随机抽取3～4张切片，Olympus光学显微镜下观察。 4、免疫组织化学方法(SABC) 取正常组和术后0d、4d、7d、10d穹窿切断组及相应假手术组大鼠下丘脑行冰冻切片，分别用兔抗大鼠CRH(1：500)和兔抗大鼠AVP(1：1000)多克隆抗体进行免疫细胞化学染色，Olympus光学显微镜下观察、照相。同时，用替代法作阴性对照实验。 5、Western blotting检测 取各组新鲜大鼠下丘脑组织，匀浆粉碎后离心，取上清，加考马斯亮蓝染液测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，转印，封闭，加一抗(CRH1：1000；AVP1：2000)4℃过夜，HRP标记IgG(1：1500)2h，DAB法显色10 min，DH_2O漂洗，PVDF膜常温晾干后进行定量检测。 6、图像分析及统计学处理 采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统，每张切片选2个视野，计算各组平均光密度(IOD)值。Western blotting结果图像扫描后分析各条带的灰度值。SPSS13.0软件进行统计学分析，结果用(?)±s表示，各组之间进行方差分析，p＜0.05表示有显著性差异。 实验结果 1、模型鉴定 正常组海马结构CA1区锥体细胞层内有丰富的胆碱能纤维，纤维粗细均匀且交织成网，很多纤维较长并形成串珠状，末端可见终扣。穹窿切断组海马结构CA1区锥体细胞层纤维变细排列紊乱且密度也降低，串珠状纤维减少，稀疏纤维随处可见，模型成立。 2、CRH免疫组化结果 正常组CRH免疫反应阳性产物呈棕黄色斑块状，主要分布于PVN小细胞核周部，延伸至突起中。假手术组各组中CRH的表达与正常组相似，无明显变化。穹窿切断后4d未见CRH表达变化；7d开始CRH表达增强；10d表达尤著，细胞数目亦见增多，胞质CRH表达明显增强。 3、AVP免疫组化结果 正常组AVP免疫反应阳性产物呈棕黄色细颗粒状，主要分布于PVN神经元细胞质内，延伸至突起中，呈串珠状。假手术组各组中AVP的表达与正常组相似，无明显变化。穹窿切断后4d未见AVP表达变化；7d开始AVP表达增强；10d表达显著，细胞数目增多，胞质AVP表达明显增强。 4、Western blotting结果 Western blotting结果显示，穹窿切断后7d下丘脑PVN CRH蛋白含量明显增加，呈逐渐增加趋势，10d CRH含量表达更高，与7d比较，有显著差异(p＜0.05)。下丘脑PVN CRH蛋白含量在正常组和假手术组中各组中有一定表达，但含量较低，且0d、4d、7d、10d变化不明显。 结论 穹窿切断使下丘脑室旁核CRH和AVP表达升高，HPA轴活动增强，海马对HPA轴的抑制作用减弱，提示海马可能是通过穹窿纤维对HPA轴发挥抑制作用。
[Abstract]:Purpose






The synthesis and secretion of corticotropin - releasing hormone and arginine vasopressin ( AVP ) in corticotropin - releasing hormone ( ACTH ) is two main regulatory peptides . These two peptides are located in the same secretory granules at the terminal end of the median eminence , and are co - released into the pituitary portal system to exert a synergistic effect on the secretion of ACTH in the pituitary . The main feature of the stress response is that the hypothalamus - pituitary - adrenal cortex axis ( HPA axis ) is activated as the core physiological and psychological response . The main feature of stress response is that the hypothalamus - pituitary - adrenal cortex axis ( HPA axis ) is activated as the core physiological and psychological response .






experimental method






1 . Experimental animals and groups






Ninety - nine adult male Wistar rats were randomly divided into fornical group ( 0 days , 4 days , 7 days , 10 days group ) and corresponding sham operation group ( only surgical incision , uncut vault ) and normal group ( 10 rats in each group ) .






2 . Establishment of rat vault cutting model






After the rats were anesthetized with 2 % sodium opental sodium , fixed to the brain stereotaxic instrument ( Jiangwan IC type ) , the skull was exposed by conventional disinfection , the skull was exposed at the distance of 1.5 mm from the anterior fontanel , 1.0 mm from the midline , then 6 mm ( cut off the dome ) , the knife was left in the brain for 5 min . After operation , routine feeding was performed under quiet conditions , and the antibiotic was infected with antibiotics .






3 . Model Identification






The cholinergic nerve fibers in CA1 region of hippocampus were stained with Karnosky method . Each group was randomly divided into 3 锝

本文编号：1835348