汉坦病毒结构蛋白基因的克

发布时间：2018-05-04 10:24

本文选题：汉坦病毒 + 系统发生树　；参考：《山东大学》2007年博士论文

【摘要】： 汉坦病毒(hantavirus，HV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属。在临床上引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantavirus pulmonary syndrome，HPS)。汉坦病毒共有30多种基因型和血清型，但中国目前为止仅发现汉滩型(Hantaan，HTN)、汉城型(Seoul，SEO)和普马拉型(Puumala，PUU)，均为HFRS的病原体。 HFRS临床上以发热、出血和肾损害为主要特征，它包括朝鲜出血热、流行性出血热和流行性肾病，每年在欧洲和亚洲有近10万病例发生。较早的报道可追溯到苏联在1913和1932年，日本军队1932年在满洲里，瑞典在1934年的暴发流行。自从1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来，各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒。引起HFRS的汉坦病毒包括HTN型、SEO型、多不拉伐—贝尔格莱德型(Dobrava，DOB)和PUU型，分别引起重度、中度和轻度的临床症状。 1993年HPS首先在美国的四角地区暴发，临床上早期出现发热、寒战等前驱症状，然后是突发性的呼吸困难，严重者导致死亡，病死率高，震惊了美国的公共卫生官员和病毒学家。研究表明该病毒病原为SN型汉坦病毒，由鹿鼠携带，随后又从不同地区的HPS病人体内分离到NY、BCC、BAY、AND等不同型别汉坦病毒。在我国尚未有HPS病例的报道。各种鼠类是汉坦病毒重要的宿主和传染源，他们各自携带不同的型别汉坦病毒。携带HTNV的黑线姬鼠主要在东亚和东欧，携带DOBV的黄颈喉姬鼠出现在南斯拉夫及邻近地区，携带PUUV的欧洲棕背鼠存在于西北欧地区，而由褐家鼠携带的SEOV在世界范围内广泛存在。汉坦病毒引起的HFRS在我国发病率高，是重点防治的传染病之一。中国HFRS病人总数占世界发病人数的90％以上，每年新发病例数4～6万。而山东省是HFRS的高发省份，年发病人数在我国常年位于前3位，2003年前则为全国第一位。山东省已发病例数占全国总病例数的1／3。可见山东省防治HFRS的工作具有极为重要的现实意义。山东引起HFRS的汉坦病毒以SEO型为主，也有HTN病毒存在，是混合疫区。对HFRS的诊断和防治归根结底取决于对其病原学的研究进展，包括病毒分离、病毒基因及蛋白质的结构与功能的研究、分子流行病学、新型疫苗、新型诊断试剂的研究与开发等，其中对汉坦病毒的基因进行分析和分子流行病学研究又是最根本和最基础的研究。而山东省分离全片段测序的病毒株太少，对它们的分子生物学性质尚缺乏深入研究。汉坦病毒颗粒为圆形或卵圆形，外层是包膜，表面有突起，由G1和G2糖蛋白(glycoprotein，GP)组成。包膜内为病毒核酸、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)和RNA聚合酶组成的核衣壳，病毒体中核衣壳蛋白成分很高。病毒基因组为单股负链RNA，由长(L)、中(M)、短(S)三个节段组成，分别编码依赖RNA的RNA多聚酶，G1和G2包膜糖蛋白和核衣壳蛋白。 G1、G2包膜糖蛋白对病毒的致病性起重要作用，包含了病毒的中和抗原位点、受体结合位点、融合肽和血凝位点。M片段中G1、G2的编码顺序为NH_2-G1-G2-COOH。M片段首先编码产生一个126 kD的糖蛋白前体(glycoprotein precursor，GPC)，然后在翻译的同时被细胞内的信号肽酶切割成G1、G2两个蛋白，组成异二聚体表达在内膜系统，部分转运至细胞膜表面，切割位点为一段绝对保守的WAASA的氨基酸序列。G1、G2共表达是二者在胞内有效转运和行使功能的基础。G1、G2富含半胱氨酸残基，维持了异源二聚体在内膜系统管腔内高度有序的空间结构。G1、G2蛋白共有5～7个N—连糖基化位点，在二聚体蛋白的正确折叠中起一定作用。G1、G2蛋白N-端都有典型的信号肽序列，C-端为跨膜区和膜内区，但至今尚未能确定G1蛋白的C-端的真正构成，因为HV的G1蛋白C-端在胞内容易被蛋白酶降解，这也成为细胞中糖蛋白表达水平低的原因之一。病毒的糖蛋白在高尔基体膜表面累积成熟后，包裹由N蛋白和基因组RNA形成的核衣壳，在高尔基体膜上出芽，通过内膜系统的转运释放到胞外。M片段基因的变异速度是三个节段中最快的，是决定HV毒力的主要因素。 HV的核衣壳蛋白在感染的细胞中高度表达，形成大颗粒状或丝状的包涵体，在包裹病毒基因组RNA、组装病毒颗粒中起重要作用。核衣壳蛋白的氨基酸序列较为保守，其免疫原性很强。其N-端的氨基酸主要是亲水性的，具有高度的抗原保守性，几乎所有的人类HV血清抗体都能识别此区；中间部分主要是亲水性区域，在不同的HV中变异较大，含有RNA结合部位。C-端则较为保守。核蛋白刺激机体产生的抗体效价比G1、G2糖蛋白高。HFPS病人血清中抗核蛋白抗体出现最早，1周后，几乎所有病人的抗核蛋白抗体均为阳性。因此，利用分子生物学技术，体外获得核蛋白的工程蛋白，并在此基础上建立新的血清学方法，是新型诊断试剂研究的热点之一。 HV的膜融合方式为pH依赖型，即HV先以受体介导的内吞方式进入细胞后，在胞内体低pH值环境下，包膜糖蛋白G1、G2结构发生变化，暴露出内部融合肽，从而触发融合。国内外学者先后证明了体外培养的不同类型的HV病毒株在酸性条件下都能引起Vero E6细胞的融合。HTN型HV致细胞融合作用的是包膜糖蛋白G1、G2，NP的共表达与否不会增减G1、G2的融合活性。在传代细胞株中，仅有40代以内的Vero E6细胞可以在HV感染后或重组表达G1、G2后产生细胞融合现象，而BHK-21、Vero细胞和过度传代(＞150)的Vero E6细胞则不会产生融合。目前尚没有确定SEO型HV糖蛋白在细胞内的重组表达是否能够引起细胞融合现象的产生。细胞融合作用是多种病毒增殖、扩散和致病过程中不可缺少的一步，因此对汉坦病毒膜融合的研究具有广泛的意义。本研究构建了汉坦病毒ZB8株M片段和JUN5-14株S片段的克隆载体，测定了基因序列，研究了山东分离的汉坦病毒毒株的遗传和变异的分子水平特点；通过M和S片段对山东分离的汉坦病毒毒株进行系统发生树分析，阐述汉坦病毒，尤其是山东株的分子流行病学特点，了解HV的变异规律，为进一步采取免疫和预防措施提供理论基础；将NP基因在BHK21细胞上做瞬时表达，对其表达特点进行了研究，并观察其做为底物检测流行性出血热病人血清中抗体的效果；构建了NP基因的酵母表达载体，并让其在毕赤酵母中得到稳定表达，检测表达特点，为构建以重组NP为底物的血清学检测试剂盒奠定基础；构建糖蛋白基因的真核表达载体，并使糖蛋白基因在Vero E6细胞中表达，观察其细胞融合现象，为糖蛋白结构和功能关系的研究、研制汉坦病毒基因工程亚单位疫苗奠定基础。一、山东株M和S片段的基因克隆和序列分析本研究为避免病毒在细胞传代引起的突变，直接从汉坦病毒感染鼠的鼠肺标本中，提取病毒RNA，根据SEO型HV的核苷酸序列及相关文献，设计引物，利用RT-PCR的方法，扩增出ZB8株HV全M片段和JUN5-14株HV S片段的NP全编码序列。并将PCR扩增片段连接T载体，并转化感受态大肠杆菌DH5α。酶切结果鉴定正确。测序后证实为SEO型HV序列。M和S片段的克隆，为研制新型诊断试剂，开发基因工程疫苗，以及结构蛋白的功能研究奠定了基础。我们对获得的M和S片段序列特征进行了分析。ZB8株的M片段基因序列测定长度为3651bp，其中A碱基1107个，T碱基1097个，C碱基682个，G碱基765个，GC含量为39.6％。开放性阅读框架(open reading frame，ORF)的位置位于47～3448 bp，编码由1133个氨基酸组成的包膜糖蛋白前体。JUN5-14株的S片段编码区基因序列测定长1290bp，其中A碱基403个，T碱基292个，C碱基257个，G碱基338个，GC含量为46.1％。编码由429个氨基酸组成的NP。我们还利用TmPred和DNAStar等软件预测了GP和NP的跨膜区、二级结构及其他蛋白质信息。我们使用DNAStar软件将测序结果与GenBank中国内外病毒株的相应序列进行了同源性分析。结果表明，JUN5-14株S片段的核苷酸序列与SEO型的各毒株的同源性在87.6～97.8％之间；ZB8株M片段的核苷酸序列与SEO型的各毒株的同源性在84.1～99.0％之间；M片段3′NCR的核苷酸序列是整个M片段中变异最频繁的部位，而5′NCR的核苷酸序列是最为保守的。虽然JUN5-14和ZB8与SEO其他各株的核苷酸序列相比变异较大，但是其氨基酸序列高度保守，，同源性分别高达98.1～99.8％和96.9～99.6％之间。系统发生树分析表明：山东株JUN5-14和ZB8株均属于SEO病毒第三亚型。与浙江分离株(Z37、ZT10、ZT71、Zy27)，北京分离株BiHD01，以及河北分离株93HBX12序列相近。其中在基于M片断序列的发生树上，ZB8株与山东GM04-38株亲缘关系最近。序列分析研究探讨了山东HV变异规律，为检测和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依据。二、汉坦病毒JUN5-14株NP基因在BHK21细胞中的表达和重组NP的抗原性分析本研究通过基因克隆的方法，以质粒pUCm-S为模板，应用PCR方法扩增出NP的全长基因，并在基因两端创建相应的酶切位点，重组入质粒pBluscriptⅡSK~+载体的T7启动子下游。酶切和测序鉴定正确，重组载体称为pBSK-NP。将重组载体转染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞中，表达2～3天后，用间接免疫荧光实验(indirect immunofluorescence assay，IFA)与SDS-PAGE和免疫印记观察蛋白的表达情况。IFA结果显示NP基因在BHK21细胞中得到了表达，在细胞中呈核周分布。SDS-PAGE和免疫印记也在48kD分子量处观察到了阳性条带。蛋白具有良好的免疫反应性，能与抗汉坦病毒特异性抗体发应。在IFA实验中，我们用重组蛋白，检测了17份HFRS病人血清和20份正常对照血清，结果显示该法检测血清抗体的敏感性为94.1％，特异性高达100％。证明了JUN5-14株NP是良好的诊断用靶抗原，为NP功能的研究，以及下一步NP基因的稳定表达和诊断试剂盒的研制奠定了基础。三、汉坦病毒JUN5-14株NP基因在毕赤酵母表达系统中的表达和抗原性分析以质粒pUCm-S为模板，应用PCR方法扩增NP的全长基因，并在基因两端创建相应的酶切位点。NP基因与pGAPZαA载体均经双酶切后连接，转化大肠杆菌DH5α，经Zeocin筛选并测序，建立了表达载体pGAPZ-NP，并酶切、测序鉴定。结果显示双酶切出现相应长度的片段，测序证实NP基因无任何突变，插入了表达载体启动子下游，并与上游信号肽序列和下游C-Myc和His6序列编码框融合。 NP基因的表达质粒pGAPZ-NP经AvrⅡ线性化后用LiCl法转化酵母菌，在YPD(含100μg／ml Zeocin)平板上两次筛选，挑出单菌落，于液体YPD中培养，并在不同时点收集培养物，用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。SDS-PAGE分析显示NP基因在毕赤酵母中得到高效稳定表达，在48h时表达量达到最高，之后趋于稳定，上清和细胞中均有蛋白表达。Western-blot分析结果表明上清和细胞中的重组NP都能与抗HV的阳性血清反应。证明所表达的NP一部分在信号肽的引导下分泌出细胞外，并经过折叠形成了正确的构象。提示NP基因在酵母菌中成功表达，且免疫反应性良好，为血清学诊断的研制奠定基础。四、糖蛋白基因的瞬时表达本研究采用PCR和基因克隆技术，将ZB8株G1、G2基因分别克隆到表达载体pCAGGS／MCS，酶切和测序鉴定正确后，将表达载体pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共转染Vero E6细胞，酸性MEM处理后观察细胞融合现象的产生。并以IFA观察糖蛋白的表达情况。结果显示在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2，IFA显示荧光信号分布在细胞浆中。二者的共表达可以产生良好的生物学活性，在酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合，而转染pCAGGS-NP的细胞没有融合现象发生。共表达也未出现明显的促进效应。本研究首次从基因水平证实了SEO型HV产生细胞融合现象的结构存在于糖蛋白G1和G2中，为糖蛋白结构与功能研究，制备有效的亚单位疫苗奠定了科学基础。从本实验结果可得出结论：本实验成功构建了含有汉坦病毒ZB8株全M片段核苷酸序列的克隆以及JUN5-14株全S片段编码区的克隆。两株病毒均是SEO型汉坦病毒，为第三亚型。表达载体pBSK-NP能在感染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞内有效地表达出NP，蛋白具有良好的免疫反应性，在IFA实验中用来检测血清抗体的敏感性和特异性均比较高，是良好的诊断用靶抗原。成功构建了含有HV NP全基因的酵母表达载体，所表达的蛋白免疫反应性良好。在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2，二者的共表达可以产生良好的生物学活性，在酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。本课题为阐明SEO型HV的遗传和变异规律，检测和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依据，为进一步研究开发新型HV诊断试剂创造了有利条件，并且为进一步研究GP的结构与功能，制备有效的亚单位疫苗奠定了坚实基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R373

【参考文献】