应用RNA干涉技术阻断EBV潜伏期基因LMP1表达的实验研究

发布时间：2018-05-23 20:38

  本文选题：小发夹RNA + 潜伏膜蛋白基因1　； 参考：《青岛大学》2006年硕士论文

【摘要】：目的 构建携带针对EBV潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆转录病毒载体,并筛选出稳定产毒的细胞克隆,探讨LMP1特异性沉默对EBV阳性细胞凋亡的影响。 方法 采用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向LMP1小发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER.retro.neo gfp,并用限制性内切酶酶切鉴定以及测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选获得稳定产生逆转录病毒的细胞克隆;收集病毒上清,感染靶细胞Raji;采用RT-PCR检测靶基因LMP1的沉默效果,流式细胞术检测Raji细胞的凋亡。 结果 ①酶切鉴定及测序鉴定结果表明插入片段的序列和方向完全正确;② 重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆;③RT-PCR结果表明pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆转录病毒可有效抑制Raji细胞中LMP1的表达,流式细胞仪检测表明LMP1沉默可导致Raji细胞凋亡,同时用细胞凋亡诱导剂TGF-β1处理时更为明显。 结论 成功构建了特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,并筛选出稳定产毒的细胞克隆,初步实验结果表明逆转录病毒载体介导的RNA干涉能有效沉默靶基因LMP1的表达,并能诱导LMP1阳性细胞Raji的凋亡,为深入探讨LMP1基因特异性沉默对EBV阳性肿瘤的治疗作用奠定了实验基础。
[Abstract]:Objective to construct the retroviral vector of pSUPER.retro.neo gfp RNAi carrying EBV latent membrane protein gene (LMP1) and to screen the stable virulent cell clones and to investigate the effect of LMP1 specific silencing on the apoptosis of EBV positive cells. Methods the oligonucleotide sequence of 60nt which could produce LMP1 small hairpin RNA(small hairpin RNA, shRNA) was cloned into the retroviral vector pSUPER.retro.neo gfp by DNA recombination technique and identified by restriction endonuclease digestion and sequencing. The recombinant retroviral vector was transfected into the packaging cell line PA317G418 by liposome method, and the stable retroviral clones were obtained. The virus supernatant was collected and infected with Raji. the silencing effect of target gene LMP1 was detected by RT-PCR. Apoptosis of Raji cells was detected by flow cytometry. Results 1 the results of restriction endonuclease digestion and sequencing showed that the sequence and direction of the inserted fragment were completely correct. The recombinant vector transfected packaging cells and expressed green fluorescent protein. After G418 screening, the resistant cell clones were obtained. 3RT-PCR results showed that pSUPER.retro.neo gfp RNAi retrovirus could effectively inhibit the expression of LMP1 in Raji cells. Flow cytometry showed that LMP1 silencing could induce apoptosis of Raji cells, especially when treated with TGF- 尾 1. Conclusion the pSUPER retro RNAi retrovirus vector which specifically silenced the LMP1 gene of EBV latency gene was successfully constructed, and the stable virulent cell clones were screened out. The preliminary results showed that RNA interference mediated by retroviral vector could effectively silence the expression of target gene LMP1 and induce the apoptosis of LMP1 positive cells Raji. It provides an experimental basis for the further study of the therapeutic effect of LMP1 gene specific silencing on EBV positive tumors.
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R346

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