人胰岛素样生长因子I（hIGF-I）前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

发布时间：2018-05-28 08:39

  本文选题：人胰岛素样生长因子-1前体 + PCR　； 参考：《南京医科大学》2007年硕士论文

【摘要】： 目的：IGF-Ⅰ诊断试剂盒目前在国际上只有美国、德国等几个国家生产，且价格极其昂贵，导致在国内临床上的应用大大受限。本室验室曾选用多种载体制备IGF-Ⅰ蛋白抗原，但效果不理想，蛋白得率均比较低，给进一步制备IGF-Ⅰ单克隆抗体及生产IGF-Ⅰ诊断试剂盒带来困难。为填补国内IGF-Ⅰ诊断试剂盒自主生产的空白，本实验在既往实验研究的基础上，选用pET32a(+)载体构建含有人胰岛素样生长因子1(human Insulin-like Growth Factor-1，hIGF-Ⅰ)前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E.coli BL21(DE3)中表达，并对此表达菌株所表达的重组靶蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及单抗制备中的应用价值。 方法：1．采用PCR法，扩增编码hIGF-Ⅰ前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a(+)／hIGF-Ⅰ重组载体。2．将其转化入BL21(DE3)中，经IPTG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化。3．用western blot法检测重组蛋白的抗原活性。 结果：重组质粒pET32a(+)／hIGF-Ⅰ经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21(DE3)表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示其表达量占细菌总蛋白量的25％左右，该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。 结论：pET32a(+)／hIGF-Ⅰ重组载体构建成功，，并能够高效表达具有免疫学特性的hIGF-Ⅰ前体蛋白，为进一步制备IGF-Ⅰ单克隆抗体及生产IGF-Ⅰ诊断试剂盒打下了良好基础。
[Abstract]:Objective at present, only the United States, Germany and other countries are producing the diagnostic kit of "1: IGF- 鈪

本文编号：1946043