建立并利用RNA干扰阵列式筛选模式研究PrP蛋白的功能

发布时间：2018-09-03 16:49

【摘要】： 朊病毒(prion)是一种由目前尚不完全清楚的独特机制引起人或动物致死性神经系统退行性病变的感染性病原。目前认为，由Prnp基因编码、在脑组织高表达的膜表面糖蛋白PrP~C转变为PrP~(Sc)是朊病毒病发生的原因。近年来PrP~C功能的研究引起了人们的普遍关注，有学者认为PrP~C的功能可能与朊病毒病中神经细胞凋亡密切相关，但是PrP~C(下文称PrP)本身的功能及其机制并不清楚。 为了研究PrP蛋白的功能，人们曾建立了一系列转基因和基因敲除小鼠模型，但结果并不令人满意。利用酵母双杂交等技术发现PrP~C可与细胞内多种蛋白质、核酸等发生相互作用，但是仍然缺乏细胞内相互作用的依据和由这种相互作用所引起的生物学功能改变的证据。因此有必要利用更有效的技术手段进行PrP功能的研究。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默，可以高效特异性抑制靶基因表达；而且新兴的高通量RNAi文库技术已经被成功应用于功能基因组学研究、信号转导途径解析和药物靶标筛选等研究领域，近年来令人瞩目。但是，目前各种形式的RNAi文库及筛选方法各有利弊。综合考虑RNAi文库技术的优点和PrP功能研究的复杂性，我们认为有必要建立经济实用的RNAi文库技术来研究PrP的功能。 为此，我们着手建立了PEI介导的反向转染小发夹RNA(shRNA)表达质粒文库阵列式筛选模式，并将其用于PrP调节STS诱导细胞凋亡的研究中。取得主要结果如下： 1．建立了RNAi阵列式筛选模式 我们构建了包括针对人类59个凋亡相关基因和6个针对人类PrP备选序列的shRNA表达质粒集合。选用一种成本较低、高效、非病毒、非脂质体的阳离子多聚物聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)作为RNAi阵列的转染试剂，建立了PEI介导的反向转染技术。结果表明，在HEK293细胞中，PEI的转染效率与商品化脂质体转染试剂Lipofectamine 2000相当，转染效率均可达到55％左右，无明显差异(x~2=0.439，P＞0.05)，但其成本相差很大。PEI介导质粒反向转染的效率高于常规转染的效率(x~2=8.598，P＜0.05)，并且反向转染过程一日即可完成，比常规转染过程简便，因此可以满足大规模RNAi阵列式筛选的需要。 为了验证质粒反向转染的基因沉默效率，我们用半定量RT-PCR和Western blot的方法验证了人PrP靶向RNAi质粒PR6对PrP表达的特异性抑制作用。通过模拟阵列式筛选，发现在针对PrP的shRNA表达质粒中，PR6质粒可以调节STS诱导的细胞凋亡，表明这种阵列可以有效用于基因功能的筛选。 2．筛选出若干与STS诱导凋亡相关的基因 为了研究PrP对STS诱导细胞凋亡的调节功能，利用PEI介导的反向转染shRNA表达质粒阵列，通过结晶紫染色、CCK-8细胞活性测定等检测，进一步筛选到包括PrP在内的P53、Cyc、Bax、CDK6、CDK7、E2F5等22个基因与STS诱导的细胞凋亡相关。其中，PrP在HEK293细胞中促进STS诱导的细胞凋亡，而通过Bax-RNAi抑制Bax的表达则可以对抗PrP的这种作用，提示Bax是PrP调节STS诱导细胞凋亡的靶点。说明我们建立的RNAi文库阵列式筛选模式可以有效运用到凋亡相关基因功能研究中，有在哺乳动物细胞内进行大规模RNAi筛选的潜能。这些筛选结果为进一步研究PrP调节STS诱导细胞凋亡的机制提供了线索。 3．证实在Neuron2A和HEK293细胞中PrP分别对STS诱导凋亡的调节作用是不同的 在上述筛选结果的基础上，为了进一步确证PrP调节STS诱导细胞凋亡的机制，我们将PrP-RNAi质粒和PrP表达质粒分别转染Neuron2A和HEK293细胞，一方面用以验证筛选得到的PrP通过Bax调节STS诱导细胞凋亡的结果，另一方面从细胞形态、细胞凋亡率的变化等多方面研究了PrP对STS诱导细胞凋亡的调节作用和机制。研究结果进一步表明，PrP在Neuron2A和HEK293细胞中均参与了STS诱导的细胞凋亡，但是效果不同：在Neuron2A细胞中，PrP被RNAi抑制后促进了STS诱导的细胞凋亡，PrP过表达则抑制了STS诱导的凋亡；而在HEK293细胞中，PrP被RNAi抑制后抑制了STS诱导凋亡，PrP过表达则促进STS诱导的凋亡。虽然PrP在这两种细胞中调节STS诱导细胞凋亡的情况不同，但是结果显示均与Bax相关，这些结论又进一步证实了我们筛选的结果。 本文以PrP正常功能为切入点，着眼于疾病相关的凋亡调控网络，建立并且应用RNAi文库阵列式筛选模式研究了PrP对STS诱导细胞凋亡的调节功能和机制，为进一步完善高通量RNAi筛选技术用于基因功能奠定了基础。并且用RNAi和PrP过表达相结合的实验来验证了筛选结果和研究了PrP的功能。应用RNAi阵列筛选研究PrP功能和机制以及有关验证PrP在不同细胞中通过Bax参与调节STS诱导的细胞凋亡的工作，未见报道。这些工作也将为朊病毒病的基础研究提供新的思路。
[Abstract]:Prion is an infectious pathogen causing fatal degenerative neuropathy in humans and animals by a unique mechanism that is not yet fully understood. It is thought that the transformation of membrane surface glycoprotein PrP~C, which is highly expressed in brain tissue, into PrP~ (Sc), encoded by Prnp gene, is the cause of prion disease. Some scholars believe that the function of PrP~C may be closely related to neuronal apoptosis in prion disease, but the function and mechanism of PrP~C are not clear.
In order to study the function of PrP protein, a series of transgenic and knockout mice models have been established, but the results are not satisfactory. It is found that PrP~C can interact with many proteins and nucleic acids in cells by yeast two-hybrid technique, but there is still no evidence of intracellular interaction and the interaction is caused by this interaction. Evidence of alterations in the biological function of PrP is therefore necessary to study the function of PrP by more effective techniques.
RNA interference (RNAi) is a sequence-specific post-transcriptional gene silencing induced by double-stranded RNA (dsRNA) molecules at the mRNA level, which can effectively and specifically inhibit target gene expression; moreover, the emerging high-throughput RNAi library technology has been successfully applied to functional genomics research, signal transduction pathway However, various forms of RNA library and screening methods have their advantages and disadvantages. Considering the advantages of RNAi library technology and the complexity of the research on the function of PrP, it is necessary to establish an economical and practical RNA library technology to study the function of PrP.
To this end, we set out to establish a PEI-mediated reverse transfection plasmid library array for small hairpin RNA (shRNA) expression, and applied it to the study of PrP regulating STS-induced apoptosis.
1. established RNAi array screening mode.
We constructed a shRNA expression plasmid set including 59 human apoptosis-related genes and 6 human PrP alternative sequences. A low-cost, efficient, non-viral, non-liposome cationic polyethylenimine (PEI) was selected as the transfection reagent for RNA arrays, and a PEI-mediated reverse transfection technique was established. The results showed that the transfection efficiency of PEI in HEK293 cells was similar to that of Lipofectamine 2000, and the transfection efficiency was about 55%. There was no significant difference between them (x~2=0.439, P>0.05), but the cost was very different. The efficiency of PEI mediated plasmid reverse transfection was higher than that of routine transfection (x~2=8.598, P<0.05). The reverse transfection process can be completed in one day, which is simpler than the conventional transfection process, so it can meet the needs of large-scale RNAi array screening.
In order to verify the efficiency of gene silencing in reverse transfection, semi-quantitative RT-PCR and Western blot were used to verify the specific inhibition of human PrP-targeted RNAi plasmid PR6 on PrP expression. Simulated array screening showed that PR6 plasmid could regulate STS-induced apoptosis in shRNA expression plasmids targeting PrP. Arrays can be used effectively for gene function screening.
2. several genes related to STS induced apoptosis were screened out.
In order to study the regulatory effect of PrP on STS-induced apoptosis, PEI-mediated reverse transfection shRNA expression plasmid array was used to screen 22 genes including PrP, Cyc, Bax, CDK6, CDK7 and E2F5, which were related to STS-induced apoptosis in HEK293 cells. Bax can inhibit the expression of Bax, suggesting that Bax is the target of PrP to regulate STS-induced apoptosis. It suggests that the RNA library array screening model can be effectively applied to the study of apoptosis-related gene function, including in mammalian cells. These screening results provide clues to further study the mechanism of PrP regulating STS-induced apoptosis.
3. it is confirmed that PrP plays a different role in regulating STS induced apoptosis in Neuron2A and HEK293 cells.
On the basis of the above screening results, in order to further confirm the mechanism of PrP regulating STS-induced apoptosis, we transfected PrP-RNAi plasmid and PrP expression plasmid into Neuron2A and HEK293 cells respectively, on the one hand to verify the screened PrP regulating STS-induced apoptosis through Bax, on the other hand, from cell morphology, apoptosis. The results showed that PrP participated in STS-induced apoptosis in Neuron 2A and HEK293 cells, but the effect was different. In Neuron 2A cells, PrP was inhibited by RNAi and promoted STS-induced apoptosis, while PrP overexpression was inhibited. In HEK293 cells, PrP inhibited STS-induced apoptosis and PrP overexpression promoted STS-induced apoptosis. Although PrP regulated STS-induced apoptosis differently in these two cells, the results showed that both were related to Bax, which further confirmed our screening results.
Based on the normal function of PrP and focusing on the disease-related apoptosis regulatory network, we established and applied RNAi library array screening model to study the regulatory function and mechanism of PrP on STS-induced apoptosis, which laid the foundation for further improving the high-throughput RNAi screening technology for gene function. The results of screening and the function of PrP were verified by experiments. The function and mechanism of PrP were studied by RNAi array screening, and the role of PrP in regulating STS-induced apoptosis in different cells by Bax was not reported.
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R346

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本文编号：2220589