载脂蛋白A-Ⅰ（apolipoprotein A-Ⅰ）及其半胱氨酸突变体结构和功能研究

发布时间：2018-09-04 06:12

【摘要】：流行病学研究表明血浆高密度脂蛋白(HDL)及其主要蛋白成分—载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)是冠心病最为重要的保护因素之一。盘状HDL或apoA-Ⅰ是体内胆固醇逆向转运过程的关键因子。而游离型(lipid-free)或与少量脂质结合(lipid-poor)形式的apoA-Ⅰ，是细胞胆固醇和磷脂最为有效的受体。成熟apoA-Ⅰ是由243个氨基酸残基组成的单一多肽，多肽链内含有8个串连重复排列片段，每一片段由22个氨基酸残基组成，呈双性α螺旋。ApoA-Ⅰ_(Milano)是apoA-Ⅰ的天然突变体，在其多肽链中apoA-Ⅰ 173位精氨酸被半胱氨酸取代，从而可通过链间二硫键形成同源二聚体(A-Ⅰ_M／A-Ⅰ_M)或与apoA-Ⅱ形成异源二聚体。临床和动物实验均显示该位点半胱氨酸突变后，能高度保护其携带者或实验动物免于发生心血管疾病；而ApoA-Ⅰ_M这些不同寻常的表现也存在于apoA-Ⅰ的另一半胱氨酸突变体apoA-Ⅰ_(Paris)，，该突变体中第151位精氨酸被半胱氨酸取代。上述两个半胱氨酸突变体分别发生于螺旋5和螺旋6两性α螺旋亲水性和疏水性界面上，突变点在多肽链上恰好相隔22个氨基酸残基。 实验目的： 本研究对野生型apoA-Ⅰ和分别发生在apoA-Ⅰ多肽链7个α螺旋片段上的半胱氨酸突变体二级结构和功能进行比较，以观察α螺旋极性和非极性界面或其附近的半胱氨酸突变如何影响apoA-Ⅰ蛋白的结构和功能；这些特定的半胱氨酸突变体的结构和功能之间是否存在某些必然联系。我们希望这些问题的解答能够对我们更深入、更全面的认识天然突变体apoA-Ⅰ_M心血管保护特性的实质有所帮助。 实验方法： 通过DNA重组、位点诱变，分别将apoA-Ⅰ 7个串联重复α-螺旋片段上相应于apoA-Ⅰ_M突变位点的氨基酸诱变为半胱氨酸，产生一系列apoA-Ⅰ半胱氨酸突变体：A-Ⅰ(S52C)、A-Ⅰ(N74C)、A-Ⅰ(K107C)、A-Ⅰ(G129C)、A-Ⅰ_M(R173C)、A-Ⅰ(K195C)及A-Ⅰ(S228C)，利用pET原核表达系统对野生型及突变的apoA-Ⅰ进行蛋白表达，Ni~(2+)亲和柱进行目的蛋白纯化，获得多肽链C-末端带有6个组氨酸标签(6×His tag)的高纯度蛋白(纯度＞90％)用于下面的结构和功能实验。我们利
[Abstract]:Epidemiological studies show that plasma HDL (HDL) and its main protein component, apolipoprotein A- 鈪

本文编号：2221247