人骨髓间充质干细胞抑制T淋巴细胞免疫反应机制的研究

发布时间：2018-09-10 11:44

【摘要】： 目的：动态观察骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)对异体T细胞内因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的影响，从而探讨其抑制T淋巴细胞免疫反应、进行免疫调节的机制，为其用于自身免疫性疾病治疗及降低移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)发生率等提供实验依据。 材料和方法：采用Ficoll密度梯度分离和体外贴壁、传代培养，从人骨髓中分离、扩增出MSCs，通过其形态的均一性及流式细胞术检测表面标志加以鉴定其纯度；通过Ficoll分离法和尼龙棉柱法获取外周血T淋巴细胞，以经丝裂霉素(mitomycin-C，MMC)处理后的1×10~5／孔MSCs作为基底层细胞，接种体外分离纯化的异体T淋巴细胞，分别于12h、24h、48h、72h、96h、5天后收集T淋巴细胞，提取RNA，逆转录成cDNA，应用荧光定量PCR(FQ-PCR)，测定T细胞内因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的mRNA表达量，动态观察四种因子的变化趋势，以确定下一步实验选择的时间点。继而将MSCs分别调整至以1×10~3、1×10~4、1×10~5个细胞／孔作为不同细胞含量组，接种于培养板，然后加入PHA刺激的外周血T淋巴细胞1×10~6／孔A组和含外周血单个核细胞(MNCs)与T淋巴细胞均1×10~6／孔的混合淋巴细胞反应(MLR)培养体系B组，培养72h，FQ-PCR检测T细胞内因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10在mRNA水平上的变化；以25％、50％和75％浓度的MSCs培养上清分别加入到PHA刺激的异体T淋巴细胞C组，共培养72h后，同样FQ-PCR检测T细胞内IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10细胞因子水平。 结果：骨髓单个核细胞接种于培养瓶后，2～4天可见成纤维样贴壁细胞出现，增殖速度较慢；7～10天克隆中的细胞增殖较快，呈旋涡状或平行排列，形态均一；约2周左右，细胞融合成单层，排列有方向性。传代细胞保持原代细胞的形态特征，生长迅速，6～8天即达完全融合。对MSCs传代细胞生长曲线的测定亦显示，3～6天是细胞快速增殖期，7天后速度减慢进入平台期。流式细胞仪检测人骨髓MSCs表面抗原，其高表达CD166、CD105、CD29、CD13，低表达CD34、CD45、HLA-DR；3代以后的MSCs纯度达到95％以上。 对一定数量的骨髓MSCs加入MLC体系中共培养，动态观察发现，在72h时，IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10mRNA含量基本达到稳定：MSCs促进IL-2、IL-4和IL-10表达(P＜0.05)，抑制IFN-γ(P＜0.05)。在A组，与未加MSCs的对照相比，不同细胞数量的MSCs和PHA作用下的T淋巴细胞共培养72h后，MSCs明显抑制T细胞内因子IL-2和IFN-γ的表达(P＜0.05)，而促进IL-4和IL-10的表达(P＜0.05)，且都呈数量依赖性(P＜0.05)。在B组，与未加骨髓MSCs的对照相比，不同细胞数量的MSCs加入MLC体系中共培养72h后，MSCs抑制T细胞内因子IFN-γ(P＜0.05)，增加IL-2、IL-4和IL-10的表达(P＜0.05)；MSCs对IFN-γ和IL-10的影响呈数量依赖性(P＜0.05)，但对IL-2和IL-4的影响在本组中未显著呈现出MSCs数量依赖性(P＞0.05)。在C组，与未加骨髓MSCs培养上清的对照相比，在不同浓度的骨髓MSCs培养上清液和PHA作用72h后，培养上清可以抑制T细胞内因子IL-2和IFN-γ表达(P＜0.05)，，且抑制呈浓度依赖性(P＜0.05)；上清液促进IL-4表达(P＜0.05)，亦呈浓度依赖性(P＜0.05)，而对IL-10影响无显著性(P＞0.05)。 结论：①骨髓MSCs可能通过细胞与细胞之间的直接接触以及分泌可溶性因子调节Th1／Th2反应平衡，抑制Th1细胞亚群的功能，发挥免疫调节作用。②T细胞在不同的刺激原作用下，MSCs对其作用的机制可能不同：在PHA作用下，MSCs主要通过抑制Th1细胞亚群、增强Th2细胞亚群的功能，以发挥免疫调节作用；而在同种异体抗原存在下，IL-2增加可能是T细胞受刺激增殖的表现。③MSCs免疫调节作用的特点将为免疫排斥和GVHD的防治以及自身免疫性疾病的临床调控提供新的实验依据。
[Abstract]:AIM: To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) on allogeneic T-cell factors IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10, and to explore the mechanism of their inhibition of T-lymphocyte immune response and immunomodulation, so as to be used in the treatment of autoimmune diseases and the reduction of graft-versus-host disea (graft-versus-host disea). The incidence rate of Se, GVHD and so on provides experimental evidence.
Materials and Methods: MSCs were isolated from human bone marrow by Ficoll density gradient separation, adherence in vitro and subcultured. The purity of MSCs was determined by morphological homogeneity and flow cytometry. Peripheral blood T lymphocytes were obtained by Ficoll separation and nylon cotton column, and then mitomycin-C (mitomycin-C). After treatment with MMC, 1 1 65507 Then MSCs were adjusted to 1 10~3, 1 10~4, 1 65 Mixed lymphocyte reaction (MLR) culture system with 10-6/pore was used in group B. After 72 hours of culture, the levels of IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10 in T cells were detected by FQ-PCR, and the supernatants of MSCs with 25%, 50% and 75% concentrations were added to allogeneic T lymphocyte C stimulated by PHA respectively. After 72 hours of co-culture, the same FQ-PCR was used to detect IL-2, IFN-4 and IL-10 in T cells. Levels of gamma, IL-4 and IL-10 cytokines.
Results: After inoculating bone marrow mononuclear cells into culture flask, fibroblast-like adherent cells appeared in 2-4 days and proliferated slowly; cells in 7-10 days of cloning proliferated faster, arranged in vortex or parallel, with uniform morphology; about 2 weeks, cells fused into a single layer and arranged in a directional manner. The growth curve of MSCs passage cells also showed that the proliferation of MSCs was rapid at 3-6 days, and the rate slowed down to plateau after 7 days. Up to 95%.
After a certain number of bone marrow MSCs were co-cultured in MLC system, dynamic observation showed that at 72 hours, the levels of IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10 mRNA were basically stable: MSCs promoted the expression of IL-2, IL-4 and IL-10 (P < 0.05), inhibited IFN-gamma (P < 0.05). In group A, compared with the control without MSCs, the T lymphocytes were fine with the control without MSCs and PHA. After 72 hours of co-culture, MSCs significantly inhibited the expression of IL-2 and IFN-gamma in T cells (P < 0.05), but increased the expression of IL-4 and IL-10 (P The expression of IL-2, IL-4 and IL-10 was increased (P < 0.05), and the effect of MSCs on IFN-gamma and IL-10 was quantitatively dependent (P < 0.05), but the effect of MSCs on IL-2 and IL-4 was not quantitatively dependent (P > 0.05). After 72 hours of A treatment, the supernatant could inhibit the expression of IL-2 and IFN-gamma in T cells (P < 0.05), and the inhibition was concentration-dependent (P < 0.05); the supernatant could promote the expression of IL-4 (P < 0.05), but had no significant effect on IL-10 (P > 0.05).
CONCLUSION: Bone marrow MSCs may regulate the balance of Th1/Th2 reaction through direct contact between cells and secretion of soluble factors, inhibit the function of Th1 cell subsets and exert immunomodulatory effect. 2. Under different stimuli, the mechanism of MSCs'action may be different. Under the action of PHA, MSCs mainly inhibit the function of Th1 cell subsets. In the presence of alloantigen, the increase of IL-2 may be a sign of T cell proliferation stimulated. 3. The characteristics of MSCs immunoregulation will provide new experimental evidence for the prevention and treatment of immune rejection, GVHD and clinical regulation of autoimmune diseases.
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

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本文编号：2234341