缺血预处理及氧化还原对大鼠钙调神经磷酸酶活性影响的研究

发布时间：2018-10-08 12:23

【摘要】： 钙调神经磷酸酶(CaN)是迄今发现的唯一受Ca~(2+)／钙调素(CaM)调节的丝氨酸／苏氨酸的蛋白磷酸酶，它广泛分布在脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞等组织细胞中，通过对底物去磷酸化参与细胞功能的调节。CaN可由Ca~(2+)介导的外部信号及细胞内的氧化还原电位共同调节。为了进一步研究CaN的作用，我们拟在不同组织中、氧化还原和脑缺血及预处理情况下，观察CaN的活性变化特点，并对其原因作进一步探究。 研究目的 第一部分： 测定不同组织中CaN活性及其钙依赖性，观察不同组织中CaN的分布和钙依赖性特点。 第二部分： 观察脑缺血及脑缺血预处理动物的脑梗死体积变化和CaN活性变化，来评价缺血预处理对缺血脑组织的保护作用。 第三部分： 观察氧化和抗氧化作用对CaN活性的影响，以了解缺血和缺血预处理在氧化还原方面保护CaN活性的可能机制。 实验方法 第一部分： 提取不同组织的CaN，测定蛋白浓度，应用紫外分光光度法测定CaN活性；配置浓度不同的CaCl_2溶液，加入反应体系使其CaCl_2总浓度为0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00mM，测定CaN活性。 第二部分： 1大鼠用水合氯醛腹腔麻醉固定后，应用Pulsinelli四血管阻断法制备大鼠全脑缺血和预缺血模型。 2TTC方法染色，观察BRI的情况。 3提取CaN，测定蛋白浓度，根据CaN测定反应体系的要求，加入相应的反应物和离子，应用紫外分光光度法测定CaN活性，反应温度为30℃，检测波长为405nm，检测间隔为30s，时间为5min。 第三部分： 取大鼠骨骼肌组织，提取CaN组织液，分六组(n＝15)做不同氧化和抗氧化处理，空白组不加任何处理，对照组加黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶，其余四组：除加入同等剂量黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶外，各组分别加入超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、甘露醇、二硫苏糖醇(DTT)，提取骨骼肌CaN，测定蛋白浓度，向各组加入相应的处理因素，应用紫外分光光度法测定CaN活性，观察变化。 实验结果 第一部分： 1不同组织CaN活性比较 应用紫外分光光度法测定CaN活力(nmol／min／mg protein)，结果为脑组织活力为6.81±2.41，与其它组比较活力最高(P＜0.01)，其次为骨骼肌组织2.08±1.65，心肌组织为1.75±0.76，肝脏组织最低0.38±0.20。 2 CaN钙依赖性 应用紫外分光光度法测定不同组织中的CaN的钙依赖性，发现所得不同Ca~(2+)浓度下CaN的活性变化在各组织中有共同点。随着Ca~(2+)浓度不断增加，CaN活性逐渐被激活，当pCa(游离Ca~(2+)浓度的负对数)超过4.52时，相当于总钙浓度为1mM，CaN活性达到最高，而随着pCa的继续上升，CaN活性又逐渐被抑制，即不同组织中CaN活性都表现为随Ca~(2+)浓度改变而呈钟形曲线变化。 第二部分： 1对照组与实验组脑组织梗死体积比较 对照组与实验组的脑组织在再灌注后，用TFC染色的方法检测梗死体积的变化，对照组与实验组的脑组织均出现了梗死区，对照组的梗死体积的百分比更大(14.83±4.37％)，实验组的梗死体积百分比在(5.82±2.98％)的范围之内，P＜0.01，有统计学意义。 2对照组与实验组脑组织CaN活性比较 在缺血预处理的条件下，CaN活性(nmol／min／mg protein)实验组5.31±1.68高于对照组3.19±1.26，具有统计学意义(P＜0.05)。 第三部分： 1黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶所产生的氧自由基(OFR)对CaN活性的抑制作用 与空白组CaN活性(nmol／min／mg protein)2.63±0.41比较，对照组1.76±0.59明显下降(P＜0.01)，黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶系统产生的OFR使CaN活性下降33.1％。 2各种抗氧化剂对CaN活性的保护作用 与对照组相比，SOD组、CAT组、DTT组CaN活性(nmol／min／mg protein)明显增高，SOD组与对照组2.05±0.38 vs．1.76±0.59，，P＜0.05，CAT组与对照组2.40±0.48 vs．1.76±0.59，P＜0.01，DTT组与对照组2.22±0.40 vs．1.76±0.59，P＜0.01，各组分别恢复到原活性的77.9％、91.3％、84.4％，具有明显的保护作用；而甘露醇与对照组1.78±0.62 vs．1.76±0.59，P＞0.05未发现有保护作用。 结论 1 CaN在大鼠体内各器官组织有广泛分布，可能参与多种器官组织的功能调节；钙依赖性实验结果表明大鼠不同器官组织中CaN对钙依赖性有共性，高钙引起的CaN活性抑制可能与CaN的内源性抑制物质有关。 2大鼠BIP可以明显减少缺血再灌注损伤后的脑组织的梗死体积，降低脑组织的损伤程度，起到保护脑组织的作用。 3通过对氧化还原反应的研究证实了SOD、CAT、DTT对CaN均有保护作用，而甘露醇效果不明显。抗氧化剂的保护机制则是减少OFR的释放及其破坏作用。 4本研究结果对缺血预处理保护缺血脑组织的作用进行了证实，并且对其保护脑组织的机制有了进一步的了解，为BRI的防治提供了一定的理论指导和思路。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

【参考文献】

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1 闫力君，李大海，魏群;大鼠大脑皮层中钙调神经磷酸酶活力的时空变化[J];生物化学杂志;1995年06期

2 范圣登,王琛,谢红;Pulsinelli四血管法大鼠全脑缺血模型制作的改进[J];苏州大学学报(医学版);2003年04期

3 魏文青,王荣杰,丛建波,孙存普;自由基与细胞信号转导[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);1999年05期

4 王春林,许鹏程,曾因明,袁丽丽,范建伟,于常州;缺血预处理对沙土鼠前脑缺血再灌注后海马羟自由基生成的影响[J];江苏临床医学杂志;2002年05期

5 张敬军,陈青,孙思琴;海马区星形胶质细胞的活化状态与缺血耐受性关系的研究[J];中国病理生理杂志;2000年02期

本文编号：2256735