骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化中免疫性发育的实验研究

发布时间：2018-10-22 17:33

【摘要】： 众所周知，中枢神经系统损伤死亡率高，致残率高。虽然近半个世纪以来，药物治疗和外科手术治疗取得了很大进展，但都仅是一种症状性治疗，无法从根本上治疗病变的神经细胞。因此，探索一种新的有效的治疗途径，已成为神经科学领域的热点课题。目前，在对中枢神经系统损伤的治疗方法中，细胞移植已成为最有潜力的治疗手段。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一种主要的成体干细胞，具有取材容易，有强大的增殖能力，在特定条件诱导下可以分化为三胚层组织细胞。近年来MSCs向神经细胞分化的能力倍受瞩目。1998年，Aziz等把人的骨髓MSC直接注射至大鼠纹状体，5～27 d后约20％的移植细胞存活并沿已知的神经干细胞迁移的路径迁移。Kopen(1999)等将骨髓MSCs注入新生小鼠侧脑室，发现12天后MSCs迁往神经元密集区域，在脑干的网状结构中发现了神经微丝(neurofilament，NF)阳性细胞，表明MSCs可分化为神经元；在纹状体和海马分子层MSCs表达了胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein，GFAP)，表明其也可分化为成熟的星形胶质细胞。应用遗传背景完全相同的MSCs进行移植是治疗神经系统疾病的最佳选择，但是供体来源有限。于是尝试不完全相合供、受体间干细胞的移植，已成为再生医学未来发展的趋势。 MSCs不表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子和共刺激分子，不能刺激T细胞增殖。在混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)体系中，MSCs可以抑制同种异体的T细胞增殖反应。将体外扩增的MSCs注射到狒狒体内，同时对狒狒进行同种异体皮肤移植，在不使用任何免疫抑制剂的情况下，该组皮肤排斥反应推迟，皮片存活时间延长(Bartholomew，2002)。同时接受同种异基因骨髓和MSCs移植患者的移植物抗宿主疾病(graft versus host disease，GVHD)的发生率明显降低(Guo，2000；Kim，2006)。将MSCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞诱导分化后即不能表达MHC，也不能刺激T细胞增殖(Le Blanc，2003a；Liu，2006)，说明MSCs不但有多向分化潜能，而且免疫原性低，具有免疫负调节作用，是一种理想的组织工程细胞。但是，近年来研究者们陆续提出不同的看法。将MSCs移植到同种异体的小鼠体内，受体体内的CD8+细胞和自然杀伤细胞增加，MSCs不能长期存活(Eliopoulos，2005)。向移植受体体内植入供体来源的MSCs后，MSCs与受体内的记忆T细胞发生免疫反应，并激发宿主抗移植物反应(Nauta，2006)。将MSCs诱导分化的成骨细胞移植至纽西兰白兔体内，随着移植时间延长，细胞的免疫抑制能力显著下降(Liu，2006)。提示在活体内MSCs仍可能激发免疫排斥反应，并不能作为一种“万能”的细胞在MHC不相容的个体间进行移植。长期以来，研究者们认为CNS是一个免疫赦免器官(Billingham，1953；Barker，1977)。但目前研究表明，中枢神经系统并不是绝对的免疫赦免区。脑内的赦免状态只是免疫赦免与免疫效应相互调节达到的动态平衡(Brabb，2000；Bailey，2006；Engelhardt，2006；)。细胞脑内移植后也可发生免疫排斥反应。目前，关于MSCs脑内移植的研究主要集中于移植后脑功能的恢复及其机制探讨。替代损伤的神经元是移植MSCs改善脑功能的机制之一。移植至脑内的同种异体MSCs以及其横向分化的神经元是否能逃避免疫排斥反应，并且长期存活呢?尚不清楚。新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于围产期各种因素导致的胎儿或新生儿缺氧、缺血引起脑组织损伤。尽管当今围产医学迅速发展，但HIBD仍是引起新生儿死亡、影响新生儿正常发育、导致儿童脑瘫、精神发育迟滞、学习障碍和癫痫等神经系统伤残的主要原因(Spong，2005)。目前临床上缺少特异性的有效手段治疗HIBD(韩玉昆，2000)。间充质干细胞移植为临床治疗HIBD开辟了一条崭新的途径。但是，由于缺氧、缺血损伤导致脑组织弥漫性病变，脑内的动态免疫平衡遭到破坏，是否会诱发对植入细胞的免疫排斥反应呢? 本试验旨在观察骨髓MSCs向神经细胞诱导分化中的免疫学特性发育，以及HIBD模型小鼠脑内移植后的免疫反应，为骨髓MSCs移植治疗新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)提供技术平台。试验分为以下三个部分：一、骨髓MSCs向神经细胞分化中的免疫原性发育目的：探讨骨髓MSCs向神经细胞分化后的移植免疫表型及其对同种异体T细胞增殖的作用。方法：体外分离和培养人骨髓MSCs。用加入碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的无血清培养基将MSCs诱导分化1周～2周；免疫荧光法和免疫印迹法进行细胞性质鉴定。将细胞分为未分化的MSCs组(MSCs组)、MSCs向神经诱导分化1周的细胞组(Neu1组)和MSCs向神经诱导分化2周的细胞组(Neu2组)。流式细胞技术和免疫印迹法检测各组细胞免疫表型；各组细胞分别与同种异体的T细胞共培养，β液闪仪检测T细胞增殖。比较γ-IFN100U／ml预处理48小时前后各组细胞的免疫表型和对T细胞的增殖作用。用spss11.0软件包及Excel7.0分析统计软件进行统计分析。结果：原代分离的骨髓为形态不均一的细胞。经传代4次后，细胞形态均一。对传4代以上的细胞行流式细胞仪检测，结果示阳性表达CD29，CD105，CD44；阴性表达CD34，CD14，CD45，说明培养的细胞表达间充质干细胞的表面标志，而不表达造血干细胞、内皮祖细胞的表面标志。将MSCs加入含bFGF、EGF的DMEM／F12(1：1)无血清培养基进行诱导分化。部分细胞5～7天后胞质向胞核收缩，胞体变小，变成多角形和不规则形。14天后可见部分回缩的胞体延纵轴伸出长长的突起，交织成网状。间接免疫荧光法检测显示，诱导前部分骨髓MSCs表达nestin，基本不表达神经元特异性烯醇酶(neuron specific enolase，NSE)、神经微丝(neurofilament，NF—L)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)；诱导分化2周时，细胞表达nestin、NSE和NF—L显著增加。GFAP在诱导分化2周的细胞中仍基本不表达。免疫印迹法检测得到相似结果。以上结果表明MSCs主要向神经元分化。流式细胞技术检测发现，诱导前MSCs组表达HLA-Ⅰ类分子的经典基因HLA-A，B，C，不表达HLA-Ⅱ类分子的经典基因HLA-DR和共刺激分子。诱导1周时和诱导2周时HLA-A，B，C、HLA-DR和共刺激分子CD80表达增加。各组间P＜0.05，有显著性差异。然而，流式细胞技术和免疫印迹检测显示诱导2周后CD40和CD86仍无表达。γ-IFN预处理后，MSCs组、Neu1组和Neu2组表达HLA-A，B，C和HLA-DR表达明显增加。与未经γ-IFN预处理的MSCs组、Neu1组和Neu2组相比，HLA分子的表达差异有显著意义(P＜0.05)。但是，流式细胞技术和免疫印迹法检测均显示，γ-IFN预处理前后共刺激分子CD40、CD80和CD86表达无明显改变。各组细胞分别与同种异体T细胞共培养6天后，结果显示MSCs抑制T细胞增殖，并且随着MSCs向神经细胞分化，抑制作用明显增强，各组间有显著性差异，P＜0.05。结论：骨髓MSCs向神经细胞诱导分化后，细胞表达HLA分子和共刺激分子CD80增加，不能表达共刺激分子CD40和CD80，并且抑制T细胞增殖，提示细胞免疫原性低，有成熟的趋势。二、向神经细胞诱导分化中的骨髓MSCs对同种异体T细胞的免疫调节作用目的：探讨骨髓MSCs向神经细胞分化后对同种异体T细胞的免疫调节作用及其可能机制。方法：骨髓MSCs原代分离、培养并向神经细胞诱导分化。MSCs向神经诱导分化后的细胞分组同第一部分。体外分离同种异体T细胞。向植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激同种异体T细胞增殖的培养体系中，加入MSCs向神经诱导分化后的各组细胞，进行共培养。比较γ-IFN100U／ml预处理48小时前后各组细胞对PHA刺激同种异体T细胞增殖的作用。采用transwell培养板分隔MSCs向神经诱导分化后的细胞和PHA刺激的同种异体T细胞培养体系。均用β液闪仪检测T细胞增殖。结果：与Con组比较，MSCs组、Neur1组和Neur2组细胞抑制PHA刺激的非特异性淋巴细胞增殖作用，各组间P＜0.05，有显著性差异。随着MSCs向神经细胞分化，体外试验中其抑制由PHA刺激的非特异性淋巴细胞增殖作用增强。γ-IFN预处理后，MSCs组、Neu1组和Neu2组细胞对非特异性淋巴细胞增殖的抑制作用增强。与未经γ-IFN预处理的三组细胞分别进行配对t检验，均为P＜0.05。与直接接触培养的各组细胞比较，采用Transwell非接触性培养对T细胞增殖无显著影响(P＞0.05)。结论：骨髓MSCs向神经诱导分化后的细胞抑制PHA刺激的T淋巴细胞增生；细胞分泌可溶性细胞因子是MSCs向神经诱导分化后的细胞抑制PHA刺激的T细胞增生的可能机制。三、缺氧缺血脑损伤模型脑内移植向神经细胞诱导分化的骨髓MSCs的免疫排斥反应目的：探讨向神经细胞诱导分化的骨髓MSCs移植至HIBD模型脑内后的免疫排斥反应。方法：7日龄新生昆明小鼠，随机分为：正常对照组(Con组)、HIBD模型组(HIBD组)、未分化MSCs移植组(MSCs组)、MSCs诱导分化1周细胞移植组(Neu1组)、MSCs诱导分化2周细胞移植组(Neu2组)。每组动物12只。根据Ditelberg(1996)报道方法制作新生小鼠HIBD模型。各移植组小鼠10日龄时，给予脑内移植1×10~5个细胞骨髓MSCs细胞悬液。采用神经行为学评分和脑组织病理学分析观察脑内移植的疗效。免疫荧光法检测移植细胞HLA DR的表达和脑组织内树突状细胞的标志物CD11C和巨噬细胞标志物Mac—1的表达。结果：与正常对照组比较，HIBD组在T迷宫强迫改变试验、放射臂迷宫试验和足错误试验中，表现明显不足。MSCs组、Neu1组和Neu2组的各项行为学测试结果较HIBD组均有明显改善。MSCs组、Neu1组和Neu2组三组间无明显差异。HIBD后4周，处死小鼠，并取脑。HIBD组、MSCs组、Neu1组、Neu2组可见左脑萎缩，Con组鼠脑未见明显异常。小鼠脑组织切片HE染色后光学显微镜下观察，Con组皮层神经元分布整齐，海马CA1区细胞排列整齐；HIBD组可见大脑皮层神经元丢失，海马CA1区细胞排列紊乱；MSCs组、Neu1组和Neu2组的神经元损伤较HIBD组有明显改善；MSCs组、Neu1组和Neu2组三组间的神经元损伤无明显差异。移植后1周，HLAⅡ类分子阳性率均低；移植后2周、4周，HLADR阳性率增高；与MSCs组比较，Neu2组HLA DR阳性率显著增高。Con组基本不表达CD11C和Mac—1；HIBD组低水平表达CD11C和Mac—1；MSCs组、Neu1组和Neu2组均可见CD11C和Mac—1阳性细胞，其中Neu2组表达较明显。结论：脑内移植MSCs及其向神经诱导分化的细胞可以改善HIBD模型小鼠的神经功能损伤。移植MSCs与其向神经诱导分化后的细胞移植比较，对HIBD模型的疗效无明显差异。MSCs及其向神经分化细胞HIBD脑内移植后，，移植细胞免疫原性增强，脑内树突状细胞和巨噬细胞聚集，可诱发免疫排斥反应。结论： 1．在体外，虽然骨髓MSCs免疫原性低，但是随着其向神经细胞诱导分化，免疫原性呈现增强的趋势； 2．向神经细胞诱导分化的骨髓MSCs具有免疫调节作用； 3．分泌可溶性细胞因子是向神经细胞诱导分化的MSCs抑制PHA刺激的T细胞增生的可能机制之一； 4．脑内移植向神经细胞诱导分化的MSCs可以改善HIBD模型的神经功能损伤，移植不同诱导分化程度的细胞对改善HIBD模型神经功能损伤的作用无明显不同； 5．HIBD脑内移植MSCs及其向神经分化的细胞后，移植细胞免疫原性增强，脑内树突状细胞和巨噬细胞聚集，可能诱发免疫排斥反应。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329

【参考文献】