人结肠上皮衰老机制的蛋白质组学研究

发布时间：2018-10-25 10:48

【摘要】： 人类的结肠具有吸收和分泌的重要机能,参与机体对水、电解质平衡的调节,维持内环境稳定。结肠的上皮细胞是致病因子与外环境作用于机体的主要靶细胞之一,也是机体许多病理变化的始发环节及主要病灶所在。衰老(aging)通常被定义为机体的正常生理功能随着年龄的增长而缓慢减退的过程,它是一种正常的、复杂的、不可逆的生物学过程,是机体的功能发生衰退及生理功能紊乱的综合表现。结肠上皮同样会随着年龄的增长而出现生理功能逐渐减退,同时恶性肿瘤等多种肠道疾病的发病率明显升高。针对结肠上皮的衰老机制,国内外也已开展了许多相关的研究:Lopes等人观察到衰老大鼠的结肠平滑肌细胞线粒体的形态和功能都发生了改变;Ono等人发现,随着年龄的增加,消化道上皮的DNA突变频率增加,而以结肠的突变频率最高;Tsurudome等发现,在老年人的结肠癌组织中8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxydeoxyguanosine)的水平升高,提示氧自由基对结肠上皮细胞DNA的损伤程度增加。以往的这些研究虽然揭示了一些结肠上皮衰老以及衰老结肠上皮对癌症易感的机理,但是这些研究多数是从某个或某几个基因出发,而结肠上皮的衰老是一个渐进的、多基因、多因素参与的复杂过程。另外,以往研究多集中在DNA和RNA水平,但由于基因转录和翻译水平的复杂性,DNA和RNA水平的变化并不能完全反映蛋白质水平的变化,而蛋白质是生理功能的执行分子,并且蛋白质的翻译后修饰状况、蛋白质的相互作用、蛋白质的动态变化等信息仅通过基因组研究是无法获知的。传统的对单个蛋白质的研究方式和研究技术已无法满足后基因组时代里对衰老这类复杂生命现象的研究要求,而以细胞内全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学的出现则为衰老研究提供了新的研究思路和技术。差异表达蛋白质组学是蛋白质组学研究的一个重要研究内容,与试图了解细胞内所有的表达蛋白质—“表达蛋白质组学”不同的是,差异表达蛋白质组学研究更多的是关注于细胞在不同生理、病理状态下的差异表达蛋白质,以期寻找或发现不同生理或病理状态下的特征性蛋白质。为此,本研究以青年人和老年人的正常结肠粘膜上皮组织为研究对象,采用比较蛋白质组学技术和方法来研究人类结肠上皮衰老相关的蛋白质,为阐明结肠上皮衰老的分子机制提供有意义的线索。首先抽提制备青年组和老年组的结肠粘膜上皮组织的总蛋白质,再应用双向凝胶电泳技术建立了重复性和分辨率均较好的青年组和老年组结肠粘膜上皮组织总蛋白质的双向凝胶电泳图谱。经银染显色,ImageScanner扫描仪扫描凝胶,PDQuest图像分析软件对两组的组织总蛋白质的双向电泳图谱进行了比较,识别两组差异表达的蛋白质点47个,再联合采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)对差异表达的蛋白质进行分析,获取MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱及ESI-Q-TOF肽序列标签,再经Mascot软件搜索SWISS-PROT蛋白质数据库鉴定了其中的38个差异表达的蛋白质。为了验证比较蛋白质组学研究结果,采用Real-time quantitativeRT-PCR和Western blot分析以及免疫组织化学技术对部分差异表达蛋白质在青年组和老年组结肠粘膜上皮组织中的表达水平进行了检测,其结果与比较蛋白质组学研究的结果一致。为了进一步验证比较蛋白质组学筛选到的差异蛋白质是否为真正的与衰老相关的差异蛋白质,本文采用D-半乳糖诱导方法建立NIH/3T3细胞复制性衰老模型,应用Western blot检测2个差异蛋白质(EF-Tu、Rhodanese)在衰老NIH/3T3细胞中的表达变化,观察到EF-Tu和Rhodanese在衰老NIH/3T3细胞中的表达水平显著下调,说明EF-Tu和Rhodanese表达下调可能与体外细胞衰老有关。本研究在建立青年组和老年组结肠粘膜上皮组织总蛋白质双向电泳图谱的基础上,采用质谱分析结合数据库搜索共鉴定出38个差异表达蛋白质,这些蛋白质按功能主要可以分为九类,即抗氧化蛋白质、信号传导类蛋白质、与凋亡相关蛋白质、分子伴侣、与蛋白质折叠相关蛋白质、基本代谢相关的酶类、转录与翻译相关蛋白质、能量产生相关蛋白、细胞骨架蛋白。因此,本研究结果提示线粒体功能受损、抗氧化能力下降和细胞凋亡增加是结肠上皮衰老的主要原因,为阐明结肠上皮衰老的分子机制提供了有意义的新的线索。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

【参考文献】