淋球菌外膜蛋白PⅠB基因原核及真核表达载体的构建、表达及初步鉴定

发布时间：2018-11-02 14:42

【摘要】： 目的：构建淋球菌外膜蛋白PⅠB原核表达载体pET30a／PⅠB和真核表达载体pcDNA3.1(-)／PⅠB，并分别在E.coli BL21和HeLa细胞中表达，为后续淋球菌PⅠB蛋白免疫学特性的研究、抗体的制备以及淋球菌核酸疫苗的研制奠定基础。 方法：通过PCR扩增淋球菌MS11菌株外膜蛋白PⅠB编码基因，构建淋球菌pET30a／PⅠB原核表达载体，测序正确后在E.coli BL21中诱导表达，，用SDS-PAGE和Western blot初步鉴定。从已测序鉴定的重组菌pET30a／PⅠB／JM109中提取重组质粒pET30a／PⅠB，酶切目的片段克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体中，构建真核表达重组体pcDNA3.1(-)／PⅠB，脂质体介导体外转染至HeLa细胞，用免疫细胞化学法检测其在真核细胞中的表达。 结果： 1．将PⅠB蛋白编码基因克隆至原核表达载体pET30a(+)，酶切、PCR和测序鉴定结果表明，插入的序列与GenBank登陆的淋球菌MS11株PⅠB蛋白的编码基因序列完全相符。 2．将pET30a／PⅠB转化入大肠杆菌BL21后，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达淋球菌外膜蛋白PⅠB，SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组质粒pET30a／PⅠB在大肠杆菌BL21能够成功表达PⅠB融合蛋白，表达的融合蛋白具有免疫反应性。 3．将pcDNA3.1(-)／PⅠB通过脂质体介导体外转染至HeLa细胞，免疫细胞化学法检测到了PⅠB蛋白的表达。 结论： 1．成功扩增淋球菌MS11菌株外膜蛋白PⅠB基因，构建了pET30a／PⅠB原核表达载体，pET30a／PⅠB原核表达载体能在大肠杆菌BL21内表达。 2．成功构建了pcDNA3.1(-)／PⅠB真核表达载体，pcDNA3.1(-)／PⅠB真核表达载体能够在HeLa细胞中表达。
[Abstract]:Objective: to construct prokaryotic expression vector pET30a/P 鈪

本文编号：2306095