γc家族细胞因子对人NK细胞发育及调节功能的影响

发布时间：2018-11-12 06:56

【摘要】： γc家族细胞因子对人NK细胞发育及调节功能的影响自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)因其无需有抗原存在或预先加以致敏就可以杀伤某些肿瘤细胞而被命名，它不表达典型的抗原识别受体(如TCR和BCR)，在通常状况下只存在于外周血、脾脏和骨髓中，但在趋化因子的作用下可游走到炎症部位发挥作用。NK细胞通过其细胞毒活性和产生的细胞因子，在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥重要的功能，是先天免疫中的一类十分重要的淋巴细胞。此外，NK细胞还是一种重要的免疫调节细胞，可以通过分泌多种细胞因子如GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等调节天然和获得性免疫应答，也可以通过细胞间的接触来活化或抑制其他免疫细胞。NK细胞调节功能的研究是近年免疫学研究的热点之一。目的 NK细胞的发育分化在天然免疫和获得性免疫的形成中占有十分重要的地位，NK细胞发育不良或功能缺陷所致威胁远大于T细胞和B细胞。在造血干细胞的发育分化中，髓系和淋巴系中的各类细胞均有较为详尽的描述，而NK细胞的研究却较少。不同分化阶段NK细胞接受各种刺激因子作用后功能和表型的变化，增殖特性的变化以及信号传导途径的变化均有益于了解NK细胞的本质及相关疾病。目前认为NK细胞的发育和成熟主要依赖于骨髓微环境，是一个极其复杂的生理过程，受到一系列细胞因子的调控，其中IL-2和IL-15是最重要的两个细胞因子。lL-2和IL-15是两种不同来源但具有相似的结构和功能的细胞因子，因为二者共用IL-2受体βγ亚单位，激活相同的信号通路，所以它们有许多相似的生物学效应，而且都能诱导CD34~+造血干细胞分化为CD56~+NK细胞。但是在越来越多地研究中表明，IL-2和IL-15的功能明显不同。IL-2~(-／-)和IL-15~(-／-)以及IL-2Rα~(-／-)和IL-15Rα~(-／-)缺陷鼠表现出的症状缺陷有着明显的差异。因此我们推测IL-2和IL-15在调节NK细胞发育中存在着差异。 NK细胞据其表面CD56分子表达密度的不同，分为CD56~(bright)和CD56~(dim)两群。CD56~(dim)NK细胞表现出较强的杀伤活性，而CD56~(bright)NK细胞杀伤活性较低。CD56~(bright)NK细胞能分泌大量的细胞因子，且在IL-2的作用下表现出较强的增殖作用；而CD56~(dim)NK细胞几乎不分泌细胞因子，且IL-2不能促其增殖。然而NK细胞两亚群的分化过程并不是很清楚，在IL-15的作用下从CD34~+造血干细胞发育分化而来的CD56~+NK细胞，从表型和功能上都类似于外周血中CD56~(bright)NK细胞。而在外周血中占绝大多数的主要执行杀伤功能的CD56~(dim)NK细胞的发育分化途径并不清楚，据推测它可能在某些刺激因素的作用下从CD56~(bright)NK细胞转化而来，也有可能是由与CD56~(bright)NK细胞共同或不同的前体细胞发育而来。从功能上分析，CD56~(dim)NK细胞类似于效应性T细胞，而CD56~(bright)NK细胞与调节性T细胞功能相近。IL-2和IL-15对效应性T细胞和调节性T细胞的作用有着明显的差异：IL-2可以活化CD8~+CTL细胞，并诱导其AICD(activation-induced cell death，活化诱导的细胞死亡)，而对Treg有较强的促增殖作用；IL-15可以维持CD8~+CTL的生存，抑制其凋亡。因此我们推测IL-2和IL-15对CD56~(bright)和CD56~(dim)NK细胞的调节作用也存在着差异。脐血中含有大量未成熟的细胞和造血前体细胞，具有分化潜能，研究这些细胞在IL-2和IL-15作用下的发育分化情况，将有利于发现某些NK细胞发育分化的线索，以及IL-2和IL-15在其中的不同作用，为以NK细胞为基础的肿瘤生物治疗提供理论依据。结核病是一种严重危害人类健康的传染病，近年随着耐药变异结核菌的不断出现，结核病又有流行趋势。目前的研究表明，γδT细胞是机体抗结核免疫反应的主要效应细胞之一，活动期结核病患者外周血中γδT细胞处于活化状态，可以直接或间接杀伤被感染的细胞。活化的NK细胞虽然可以直接杀伤被结核杆菌感染的细胞，但是在多耐药结核病患者体内NK细胞的功能明显降低，而其体内γδT细胞的数量减少，活性下降。人体内NK细胞和γδT细胞活化状态的变化提示二者可能存在某种联系。 NK细胞不仅是一种重要的免疫效应细胞，也是一种重要的免疫调节细胞。NK细胞可以通过分泌多种细胞因子如GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等调节天然免疫和获得性细胞免疫应答，也可以通过细胞-细胞间的接触来活化或抑制其他免疫细胞。研究NK细胞对γδT细胞的调节机制，将有利于为结核病的免疫治疗提出一种新的治疗理念和方案，同时希望能为NK细胞基础功能的研究提出一些新的观点。方法 1．分离CBMC，加入IL-2和IL-15进行培养，动态监测CD3、CD16、CD25、CD34、CD56、CD94、CD117、CD122、CD132、CD158a、CD161、IL-15Rα等表面标志的变化； 2．利用CFSE染色技术，检测特定细胞亚群的增殖情况； 3．利用胞内细胞因子染色技术，检测特定细胞IFN-γ的分泌情况； 4．利用MACS和FACS纯化细胞，检测特定纯化细胞在不同刺激因素作用下的变化情况； 5．利用Annexin V染色和胞内Bcl-2和Bcl-xL染色，分析细胞亚群的凋亡情况； 6．利用~(51)Cr检测NK细胞对K562细胞的杀伤活性； 7．分离PBMC，加入M．tb Ag和／或IL-2进行培养，检测细胞表面分子表达变化的情况，分析细胞亚群的比例变化和细胞表型的改变； 8．利用ELISA试剂盒，检测细胞培养上清中各种细胞因子的表达情况； 9．利用激光共聚焦显微镜和荧光抗体，观察细胞-细胞之间的免疫突触，及相关分子在细胞表面分布的情况。结果 1．1L-2和IL-15对脐血NK细胞产生不同的作用。在长期体外培养中，低剂量IL-15促进脐血NK细胞增殖的效果十分明显。IL-2和IL-15都能提高NK细胞的杀伤活性和分泌IFN-γ的能力，IL-2的作用迅速而短暂，而IL-15的作用则缓和而持久。IL-15可以促进CD56~(bright)和CD56~(dim)NK细胞的增殖，并维持其长期存活。IL-2对脐血NK细胞只在早期表现促增殖作用，且对CD56~(bright)NK细胞的作用强于CD56~(dim)NK细胞。此外，IL-2可以诱导CD56~(dim)NK细胞的AICD，而IL-15则通过诱导Bcl-xL的高表达来发挥抗凋亡的作用。无论是IL-2还是IL-15培养，抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xL在CD56~(bright)NK上的表达都高于CD56~(dim)NK细胞。此外，IL-15可以诱导NK细胞特别是CD56~(bright)NK细胞表达CD25，而IL-2无此作用。 2．IL-2和IL-15对脐血T细胞的影响存在差异。 IL-2对脐血T细胞的促增殖作用强于IL-15，而且IL-2能诱导T细胞高表达CD25。 3．脐血与成人外周血NK细胞的表型存在差异。新鲜分离CBMC和PBMC，FACS检测结果显示，脐血NK细胞的主要表型为CD56~(+／-)CD16~(bright)，与外周血NK细胞的主要表型CD56~(dim)CD16~+，有较大的不同。成人外周血CD56~+NK细胞的比例为13.27±3.84％，明显低于脐血(25.26±7.34％)。脐血NK细胞还表达CD94、CD122(IL-2Rβ)、CD132(IL-2Rγ)、CD158a等分子，少量表达CD25(IL-2Rα)。此外脐血中还含有2-4％的CD34~+细胞，而正常成人外周血不存在该种细胞。 4．IL-2和IL-15对成人外周血NK细胞的影响较弱。低剂量IL-2和IL-15对成人外周血NK细胞和T细胞的促增殖作用都较弱，且二者无显著性差异。 5．NK细胞正向调节γδT细胞的功能。 NK细胞的功能状态与γδT细胞的增殖正相关；清除NK细胞的PBMC(NK-depleted PBMC)中γδT细胞对M．tb Ag的特异增殖反应受到抑制。 6．在IL-2的协同下M．tb Ag可以特异地活化NK细胞。 NK细胞可以被M．tb Ag活化，活化的NK细胞调节γδT细胞对M．tb Ag的免疫反应，这一过程是IL-2依赖的。 7．NK细胞通过分泌细胞因子和CD54／LFA-1的相互作用调节γδT细胞的功能。 M．tb Ag可以诱导NK细胞分泌IL-12、GM-CSF、TNF-α，但不表达IL-4、IL-10；IL-12、GM-CSF、TNF-α单独或联合作用可以促进γδT细胞的增殖，但不能取代NK细胞来调节γδT细胞对M．tb Ag的应答；IFN-γ不参与NK细胞对γδT细胞的调节作用；Transwell实验表明，除了分泌细胞因子，NK细胞还可能通过细胞-细胞间接触的方式调节γδT细胞对M．tb Ag的特异性增殖反应；FACS、激光共聚焦显微镜和抑制实验证实NK细胞通过其表面的CD54分子和γδT细胞形成免疫突触，调节γδT细胞对M．tb Ag的特异性增殖反应。结论 1．IL-15可以促进脐血CD56~(bright)和CD56~(dim)NK细胞的增殖，并维持其长期存活，不断提高NK细胞IFN-γ的分泌能力和杀伤活性；而IL-2对脐血NK细胞只在早期表现促增殖作用，后期诱导CD56~(dim)NK细胞的凋亡，，导致NK细胞功能下降。 2．由于存在IL-2—IL-2Rα正反馈环路，IL-2对脐血T细胞的作用更强。 3．脐血NK细胞的表型与成人外周血明显不同。脐血NK细胞可能是未成熟的细胞。 4．IL-2和IL-15对成人外周血NK细胞的促增殖作用无显著性差异。 5．在IL-2的作用下，NK细胞可以被M．tb Ag活化，活化的NK细胞调节γδT细胞对M．tb Ag的免疫反应。 6．NK细胞通过分泌细胞因子(主要是GM-CSF、TNF-α、IL-12)和细胞与细胞间接触两种方式调节γδT细胞对M．tb Ag的反应。
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【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【共引文献】