HSP90与GC-GR效应差异的关系研究

发布时间：2018-11-19 07:36

【摘要】： 机体在各种应激或某些药物的影响下糖皮质激素-糖皮质激素受体(GC-GR)效应会发生显著的改变。而热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是体内普遍存在、高度保守的一类分子伴侣蛋白,也是GC-GR效应中的重要伴侣蛋白。正常情况下热休克蛋白90与糖皮质激素受体以及其他伴侣蛋白如HSP70、HIP、HOP、HSP40结合形成多聚体,使受体形成适合配体糖皮质激素结合的活性结构,当配体进入细胞内和受体特异结合,热休克蛋白就从复合物中解离出来,GC-GR复合物便进入核内发挥其生物效应。因此,热休克蛋白90作为Gc-GR效应通路中关键环节,其结构和数量的变化将会影响糖皮质激素生物效应的发挥。研究表明同系不同株的小鼠BALB/C和C57BL/6不但在创伤后表现出炎症反应和创伤修复的差异,且在耐热、耐机械、抗辐射损伤和免疫反应方面表现出显著差异。同样,在临床上也可见到用糖皮质激素治疗的相同疾病的患者对于同样剂量的激素治疗的敏感性也有不同,有证据表明遗传因素在这一过程中扮演重要角色,如GR的基因变异会导致激素治疗敏感性的差异,但仅少数患者检测到GR的基因突变。上述过程都与GC-GR效应密切相关,而HSP90是GC-GR效应通路中的重要分子,它的变化与GC-GR效应差异的关系引起了我们的关注。本室前期的实验发现C57BL/6小鼠较BALB/C具有较强的应激耐受能力,随后对其HSP84(相当于人HSP90β)基因全长进行了测序,发现了4个有意义突变位点,这是否与前面所观察到的应激耐受差异有关?本室对此做了进一步研究,首先检测了全身冲击伤(systemic blast injury,SBI)应激模型条件下两品系小鼠HSP84的表达量有无差异,并将C57BL/6小鼠的HSP84基因转入BALB/C成纤维细胞,观察其在热应激后糖皮质激素受体的核转位变化情况。结果表明,SBI应激条件下,两品系小鼠的HSP84表达均有显著升高,但品系间无显著差异;但转入C57BL/6小鼠的HSP84基因的BALB/C成纤维细胞较转入BALB/C小鼠HSP84基因和转入空质粒的同种细胞具有更强的核转位能力。因此,我们推测HSP84基因的结构变化对GC-GR效应有显著的影响。由于有较多的分子参与GC-GR效应通路,为排除其他分子的影响,本课题将以遗传背景相似的BALB/C和C57BL/6成纤维细胞为研究对象,采用热应激模型观察在给予药物阻断热休克蛋白90的情况下GC-GR效应的差异及其变化,验证HSP90基因差异是引起应激效应差异的重要原因之一。同时,我们将收集大批量经糖皮质激素治疗的原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)病例,通过特异性扩增HSP90β基因的二聚化区域和核转位区域进行基因测序,筛查HSP90基因突变,确定GC治疗敏感和不敏感各组PNS患者各种基因型的发生率,确定基因多态性与GC治疗敏感差异性的关系。主要研究内容和结果如下: 1.采用C57BL/6和BALB/c小鼠成纤维细胞42℃热应激模型,该模型具有稳定性好,致伤均一,重复性好,便于操作等优点,并且避免了细胞的污染。 2. C57BL/6和BALB/c小鼠成纤维细胞在42℃热损伤情况下的细胞存活率、细胞增殖活力均较正常对照组减弱,LDH释放增加,GR核转位明显增强,并且两品系小鼠成纤维细胞之间有显著差异,结果表明C57BL/6小鼠成纤维细胞具有更强的热损伤耐受力。 3.热应激小鼠成纤维细胞在给予地塞米松50nM后, C57BL/6和BALB/c小鼠成纤维细胞的损伤明显减轻,GR核转位明显增强,提示地塞米松可通过增强GR核转位对热应激小鼠有保护作用,对C57BL/6小鼠成纤维细胞的保护作用强于BALB/c小鼠。 4.在给予热应激小鼠成纤维细胞地塞米松50nM的同时给予HSP90特异性抑制剂格尔德霉素后,地塞米松对两品系小鼠成纤维细胞的保护作用均被减弱。较低剂量0.1uM时BALB/c小鼠成纤维细胞的损伤较C57BL/6小鼠更为严重,两品系小鼠间有显著差异。较高剂量1uM和10uM时,GR核转位明显受阻,但两品系小鼠成纤维细胞间仅LDH释放有显著差异,其余指标无明显差异,表明当HSP90被完全阻断后,两品系小鼠成纤维细胞间的热应激耐受差异就消失,提示HSP90是导致这种差异的重要原因之一。 5.通过特异性扩增HSP90β基因的二聚化区域和核转位区域(6923bp-7803bp,参考Genebank Accession number:J04988)并进行基因测序,发现在经糖皮质激素治疗的肾病综合征患者中存在2个位点基因变异,分别为位于intron 10的7489 CT和3’非编码区的7612 CT基因突变。 6.在被检测的经糖皮质激素治疗的155例肾病综合征患者中包括激素治疗敏感患者85例和不敏感患者70例,其HSP90β基因7489 CT突变的频率分别为2.4%和4.3%,突变位点多态性分布无统计学差异(P 0.6)。HSP90β基因7612 CT突变的频率分别为2.4%和2.9% ,突变位点多态性分布无统计学差异(P 0.5)。以上结果提示HSP90β表达量与GC治疗敏感性无显著相关,因为HSP90β非翻译区突变只影响表达量,推测HSP90β的含量变化与激素治疗敏感性无关,而HSP90β的结构变化可能是引起糖皮质激素治疗敏感性差异的主要因素,但结构差异来自基因的何处突变还需进一步的研究。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R362

【参考文献】