生殖支原体P32重组蛋白的表达、纯化及其对HeLa细胞的黏附作用

发布时间：2018-11-20 04:54

【摘要】：目的：构建含生殖支原体(Mycoplasma genitalium，Mg)p32基因的重组表达载体，在大肠埃希菌(E．coli)中诱导表达，纯化表达产物并研究其在Mg对HeLa细胞黏附过程中的作用，以便从细胞和分子水平进一步探索Mg对宿主细胞的黏附机制。 方法：相关软件分析Mg的p32基因序列，设计特异性引物，以Mg标准株G37为模板行聚合酶链反应(PCR)扩增p32全长843bp片段；经双酶切、连接反应将p32克隆入原核表达载体pET-30a(+)，构建重组质粒pET-30a(+)／P32：连入的p32基因片段经测序鉴定正确后，人工定点诱变该基因中的TGA密码子为TGG；将诱变后测序正确的重组质粒转化入E．coilBL21(DE3)，用IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定表达结果，Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，BCA法测定其浓度；将G37和纯化的P32重组蛋白(rP32)分别免疫新西兰兔，用所得相应抗血清分别行黏附试验和黏附抑制试验。 结果：PCR扩增出约843bp的目的片段；构建的重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定表明其中插入的目的片段与GenBank上登录的G37的p32基因序列完全一致。通过PCR介导的定点诱变，p32中的TGA被成功突变为TGG。SDS-PAGE分析显示，在IPTG诱导下，重组工程菌中表达了一相对分子量(M_r)约为37.6 KDa的目的蛋白，该目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在，，Western blotting检测其能与G37免疫新西兰兔所得血清发生特异性反应。用
[Abstract]:Aim: to construct a recombinant expression vector containing the p32 gene of mycoplasma genitalium (Mycoplasma genitalium,Mg), induce expression in Escherichia coli (E.coli), purify the expression product and study its role in the process of Mg adhesion to HeLa cells. In order to further explore the adhesion mechanism of Mg to host cells at cellular and molecular level. Methods: the p32 gene sequence of Mg was analyzed and specific primers were designed. The p32 full-length 843bp fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using Mg standard strain G37 as template. After double enzyme digestion, ligation reaction, p32 was cloned into prokaryotic expression vector pET-30a (), to construct recombinant plasmid pET-30a () / P32: the p32 gene fragment was identified correctly by sequencing. The TGA codon of the gene was mutated to TGG; by artificial site-directed mutagenesis. The recombinant plasmid was transformed into E.coilBL21 (DE3) after mutagenesis. The expression was induced by IPTG. The expression results were analyzed and identified by SDS-PAGE and Western blotting. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and its concentration was determined by BCA. New Zealand rabbits were immunized with G37 and purified P32 recombinant protein (rP32) respectively. Adhesion test and adhesion inhibition test were performed with the corresponding antiserum. Results: the target fragment of about 843bp was amplified by PCR, and the recombinant plasmid was identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The result showed that the inserted target fragment was identical to the p32 gene sequence of G37 registered on GenBank. By site-directed mutagenesis mediated by PCR, the TGA in p32 was successfully mutated into TGG.SDS-PAGE. Under the induction of IPTG, a target protein of 37.6 KDa was expressed in the recombinant engineering strain. The target protein was detected by, Western blotting in the form of inclusion body, which could react specifically with the serum of New Zealand rabbits immunized with G37. With
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R375

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本文编号：2343804