神经干细胞共移植体体外构建的实验研究

发布时间：2018-11-21 13:44

【摘要】： 目的:通过实验筛选合适的细胞外基质,利用脑微血管内皮细胞(vascular endothelial cells VECs)、细胞外基质与神经干神胞(neural stem cells NSCs)共同构建神经干细胞共移植体,以提高移植神经干细胞存活和定向分化为神经元,减少其凋亡。 方法:实验分为两个部分。一是利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从新生Wistar大鼠(1-3d)海马分离NSCs,进行体外扩增培养、传代,采用免疫组织化学法和荧光法做nestin染色鉴定;利用M199培养基,从新生1-7d Wistar大鼠大脑中分离脑微血管内皮细胞,进行体外扩增培养,采用免疫细胞化学方法鉴定;选用不同的细胞外基质包括多聚赖氨酸(poly-L-Lysine),层粘连蛋白(LN)、Matrigel与两种细胞进行贴壁共培养,镜下观察与三组细胞外基质共培养NSCs的存活、增殖、分化情况;采用免疫细胞化学方法观察不同时间点(3d、7d、14d)NSCs定向分化为神经元、星形胶质细胞情况及NSCs增殖、凋亡情况。二是NSCs共移植体构建及检测:将传代的脑微血管内皮细胞用0.25%胰酶消化20min后,以3×10~7L~(-10的密度接种在培养瓶中,12h贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养液,涂以一层细胞外基质后,接种经0.125%胰酶消化20 min后吹打成单细胞NSCs悬液,密度为6×10~8L~(-1),加入NSCs完全培养液。培养3-6h镜下观察NSCs完全贴壁后,吸出培养液,再涂以一薄层细胞外基质,再接种以上相同密度的脑微血管内皮细胞,加入NSCs完全培养液,共培养12-24h,形成分层结构(VECs-细胞外基质-NSCs-细胞外基质-VECs),经适力吹打形成NSCs共移植体,利用免疫荧光的方法,以Ⅷ因子标记物标记脑微血管内皮细胞,用nestin标记NSCs,检测共移植体。将不同基质构建的共移植体接种于放有盖玻片的六孔板中,加入神经干细胞培养液,在3d、7d、14d镜下观察共移植体的生长情况。 结果: 1、NSCs和VECs形态学观察及鉴定:原代分离的单NSC 4d增生为神经细胞球,传代后,经nestin免疫荧光染色,细胞球呈阳性;原代培养脑微血管内皮细胞6-8d长满瓶壁,细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形,VIII因子相关抗原阳性。 2、三种细胞外基质对NSCs分化影响:3d时MAP2免疫组化阳细胞数,由层粘连蛋白参与的共培养明显高于由Matrigel、多聚赖氨酸参与的共培养(P0.05);7d时差距更加明显(P0.01);14d时LN组高于Matrigel组差距不时显,且两者明显高于多聚赖氨酸组(P0.01)。3d时GFAP免疫组化阳细胞数,由层粘连蛋白参与的共培养高于由Matrigel、多聚赖氨酸参与的共培养(P0.05),7d时三组差距不明显,14d时多聚赖氨酸组和Matrigel组差距不明显,但两者明显高于LN组(P0.05)。3d、7d、14d时,GFAP+ MAP_2免疫组化阳细胞数,由层粘连蛋白参与的共培养明显高于由Matrigel、多聚赖氨酸参与的共培养(P0.01) 3、LN的细胞粘附性较好,两种细胞参与共建细胞数较高,共移植体平均细胞数8-15个,平均共移体直径28μm,较合适体内移植。 4、共培养中神经干细胞的增殖和凋亡的检测:随着天数的增加,神经干细胞数也随之增加,但3d时,LN组和Matrigel组Brdu阳性细胞数明显高于多聚赖氨酸组(P0.05),7d时Brdu阳性细胞数各组均增多,但LN组和Matrigel组Brdu阳性细胞数明显高于多聚赖氨酸组(P0.01),14d时各组细胞增殖明显,LN组和Matrigel组Brdu阳性细胞数明显高于多聚赖氨酸组(P0.01);在三个时间点(3d、7d、14d)可见LN组和Matrigel组Caspase/Brdu双阳性细胞数明显低于多聚赖氨酸组。 5、共移植体活细胞镜下所见及免疫荧光结果:通过分层贴壁共培养和适力吹打可以形成LN、VECs和NSCs特征性结构。这种结构以VECs和NSCs紧密相贴或VECs半包NSCs为等征。镜下可见共移植体细胞团不规则,NSCs被脑微血管内皮细胞包绕或相互连贴,脑微血管内皮细胞细胞核大,胞体不规则,明显大于NSCs,NSCs折光性强。在200倍视野下,随机选取100个共移植体进行细胞计数,可见平均细胞数为8-15个,其中脑微血管内皮细胞数平均2.8个。免疫荧光可见红色VIII因子阳性VECs包被绿色nestin阳性NSCs,或相互粘贴。 结论: 1.层粘连蛋白具有良好的细胞粘附性,可使神经干细胞与脑微血管内皮细胞间很好的粘附,可形成大小适中的神经干细胞共移植体。 2.层粘连蛋白较多聚赖氨酸和Matrigel有更好的促进神经干细胞分化的能力,并诱导其定向分化为神经元;从而使神经干细胞分化为胶质细胞数较少,有利于共移植体植入体内发挥神经替代作用。 3.层粘连蛋白能提高神经干细胞存活,促进神经干细胞的增殖和内皮细胞增殖,并通过内皮细胞间接地促进神经干细胞增殖。 4.层粘连蛋白较多聚赖氨酸和Matrigel有更好地促进神经干细胞分化时轴突生长的作用,并且可促进神经干细胞的迁移。 5.层粘连蛋白是构建神经干细胞共移植体较理想的细胞外基质,以脑微血管内皮细胞为支持细胞,以层粘连蛋白为细胞外基质,经分层立体共培养(VECs-LN-NSCs-LN-VECs),适力吹打可以成功构建适合体内移植的神经干细胞共移植体。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：佳木斯大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329

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本文编号：2347145