阴道毛滴虫可溶性抗原组分分析

发布时间：2018-12-07 14:46

【摘要】： 阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)是一种常见的性传播疾病，人群普遍易感。据报道全世界每年约有170万感染病例。阴道毛滴虫是一种具有鞭毛的寄生性原虫，人体感染后可引起一系列的临床症状。约50％的妇女感染阴道毛滴虫后无任何症状，其中1／3的妇女6个月内可发展成为有症状的感染者。急性感染可出现宫颈阴道黏膜上皮出血、脱落等急性阴道炎症状。慢性感染可引起性交时痒痛。此外研究表明滴虫病与宫颈癌、非典型盆腔炎症、妇女不育症有关。孕妇感染阴道毛滴虫后可导致胎膜早破、早产，低体重儿。男性感染阴道毛滴虫后大多无症状，部分可引起尿道炎，前列腺炎。另外阴道毛滴虫也是增加人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的因素。阴道毛滴虫最常见的病原学诊断方法是在显微镜下直接观察。该诊断方法尽管操作简便且所需费用较低，但敏感度较差，与培养法相比较敏感度仅达到其35％-80％，同时要求检验人员有较丰富的临床诊断经验。目前被公认的诊断阴道毛滴虫感染“金标准”是培养法，常用的培养基包括Diamond's，Trichosel和InPouch TV培养基。但尚无任何一种培养基，单一诊断阴道毛滴虫感染时敏感度达到100％，且该方法费时费力，诊断费用较昂贵。国内外学者对阴道毛滴虫感染的免疫学诊断进行了大量研究，由于抗原成份复杂，对该虫感染者进行免疫学诊断时，其抗原常与其他寄生虫病患者的血清交叉反应而出现假阳性，特异性较差。为了寻找诊断该病的特异性抗原，本研究应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对阴道毛滴虫可溶性抗原进行分析，然后与经该虫免疫小鼠血清进行免疫印迹(Western blot)，为建立敏感、特异的滴虫感染免疫学诊断方法奠定基础。材料与方法 1．阴道毛滴虫虫体培养阴道毛滴虫虫株取自妇女阴道分泌物，接种到肝浸汤进行培养。虫体培养生长24h后，室温下离心(500×g)虫体，后用PBS缓冲液(pH7.2)洗涤。 2．阴道毛滴虫虫体可溶性抗原制备虫体分别反复冻融、超声粉碎、离心，取上清作为虫体可溶性抗原，，并测定抗原的浓度。 3．阴道毛滴虫虫体多克隆抗体制备BALB／c小鼠每5只随机分为一组进行免疫，以在-80℃冷冻保存备用的阴道毛滴虫虫体作为抗原，采用背部皮下多点注射进行免疫。首次免疫采用福氏(Freund adjuvant)完全免疫佐剂，加强免疫采用福氏不完全免疫佐剂，佐剂与抗原的体积之比为1：1。每2周免疫一次，在第2次加强免疫2周后通过眼球取小鼠血，获取鼠抗阴道毛滴虫虫体血清。 4．抗体效价检测ELISA检测鼠抗阴道毛滴虫虫体血清抗体滴度。 5．样品制备可溶性抗原与样品缓冲液1：4混合，在100℃热水中加热3-5分钟。 6，SDS-PAGE用Bio-Rad电泳系统对上述抗原进行SDS-PAGE分析，采用10％的分离胶和5％的浓缩胶。充分染色、褪色后可看到各自不同的电泳带。根据标准蛋白分子量蛋白带的迁移率及其分子量的对数绘制标准曲线，测量各条蛋白带的迁移率，查出与其对应的分子量。 7．Western blot抗原转移至硝酸纤维素膜上采用Western blot对阴道毛滴虫虫体可溶性抗原进行免疫分析。结果 1．鼠抗阴道毛滴虫虫体免疫血清抗体滴度检测阴道毛滴虫虫体3次免疫小鼠半月后，取血清经ELISA检测血清抗体滴度达1：100000。 2．电泳样本蛋白含量的选择加样孔内蛋白含量的不同，电泳带清晰度有所差异。样品浓度越高，加样量越少，电泳效果越好，用Bio-Rad公司的Mini电泳系统时，加样量在18μg／孔，电泳效果最好。 3．阴道毛滴虫虫体可溶性抗原电泳分析阴道毛滴虫全虫可溶性抗原经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色显示32条蛋白带。在32条全虫抗原蛋白带中，分子量在100kDa以上有9条，其余在15～97kDa之间，主带有8条，分别是110、97、75、60、57、34、26、和15kDa。 5．阴道毛滴虫虫体可溶性抗原免疫印记分析在SDS-PAGE凝胶中的阴道毛滴虫可溶性抗原32条蛋白带中显示广泛的免疫反应，除86、75和22kDa处均未显示棕色条带，无免疫原性，其余各条蛋白带均有反应。且以110、97、60和26kDa免疫反应性最强，显色最深为主要反应带。值得注意的是，SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色不清楚的蛋白带经酶联免疫染色后变为清晰可见，如大于100kDa的3条蛋白带，90、72、46及18kDa。可见有些滴虫抗原量虽少，却可产生明显的免疫反应。结论 1．阴道毛滴虫虫体可溶性抗原电泳分析阴道毛滴虫全虫可溶性抗原有32条蛋白带，主带为110、97、75、60、57、34、26、和15kDa。 2．阴道毛滴虫虫体可溶性抗原免疫印记分析阴道毛滴虫可溶性抗原中的110、97、60、26kDa分子量的蛋白组分对特异性诊断阴道毛滴虫具有重要价值。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】