胰岛素对小鼠早期胚胎发育的程序化影响及相关分子机理的研究

发布时间：2018-12-08 07:23

【摘要】： 本研究利用糖尿病模型小鼠和胰岛素处理体外培养的2细胞胚胎至囊胚期,研究早期发育环境中的胰岛素对F1和F2代生长和胰岛功能的代谢程序化影响;通过检测印迹基因Igf2和H19在早期胚胎的表达和印迹控制区DNA甲基化的变化;采用基因表达谱芯片筛选相关的差异表达基因,以探讨胰岛素胎儿程序化作用的可能机理。 1.胰岛素对小鼠早期胚胎发育的程序化影响 1.1不同剂量STZ诱导糖尿病模型小鼠通过一次性腹腔注射150 mg/kg b.w.和200 mg/kg b.w.的链脲菌素(STZ)以制作小鼠糖尿病模型;采用葡萄糖测定试纸和尿液分析试纸条联合检测模型小鼠血糖和尿糖的变化。注射STZ后第4周测定小鼠血清葡萄糖和胰岛素浓度,光镜观察胰岛的组织学改变,并使模型小鼠与正常雄鼠交配,观察交配和妊娠情况。结果表明:对照组血糖在观测期基本无变化,模型组血糖水平逐渐增加,三周后稳定。高剂量组血清葡萄糖浓度明显升高(P＜0.001),血清胰岛素水平极显著下降(P＜0.001);胰岛形态破坏严重;低剂量组小鼠血清葡萄糖分升高组和正常组,但血清胰岛素浓度均明显降低(P＜0.01),胰岛内可见炎性细胞浸润。血糖升高组小鼠交配能力下降,交配率仅为46.9%,流产率为73.9%,仔鼠出生死亡率为20%。结论:不同剂量的STZ均能诱发糖尿病,且影响雌鼠的交配能力和胚胎的生长发育。 1.2母体低胰岛素、高血糖环境对子代生长发育和胰岛功能的程序化影响 STZ诱导的糖尿病模型小鼠与正常雄鼠交配产下F1代,F1代雌鼠成年后,与正常雄鼠远交产下F2代,观察母体低胰岛素、高血糖环境对子代(F1和F2)生长发育和胰岛功能的程序化影响。结果显示:试验组F1代畸形率为9%,仔鼠出生重下降26.5%(P＜0.01)。F1代试验组血清葡萄糖浓度比对照组升高24.7%(P＜0.05),血清胰岛素浓度比对照组下降26%(P＜0.05)。F2代试验组血清葡萄糖浓度与对照组没有差异,但血清胰岛素浓度比对照组下降14.3%(P＜0.05)。F1代、F2代成年鼠胰岛素耐量损伤,产生胰岛素抵抗,胰岛凋亡细胞比例升高。提示:糖尿病母体环境影响子代胚胎发育和成年后产生胰岛素抵抗,这种影响可以传递至F2代。 1.3植入前胚胎胰岛素处理对子代生长发育和胰岛功能的程序化影响将小鼠2细胞胚胎培养于KSOM+0.25μg/ml Insulin的培养液中,发育至囊胚后转移到假孕母鼠子宫。产下的雌鼠成年后(6周龄),与正常雄鼠远交产下F1代,观察暴露于高胰岛素环境的早期胚胎及其子代生长发育和胰岛功能的程序化影响。结果显示:试验组囊胚发育率升高16.4%(P＜0.05),仔鼠出生重升高17.8%(P＜0.05)。试验组成年小鼠血清葡萄糖和胰岛素浓度与对照组均无明显差异,但胰腺凋亡细胞明显增多,并显示口服葡萄糖和胰岛素耐量损伤;F1代试验组血清胰岛素浓度比对照组下降14.3%(P＜0.05),胰岛素耐量损伤,产生胰岛素抵抗。提示:胰岛素能促进早期胚胎生长,但会造成成年以及F1代小鼠胰岛素抵抗。 2.胰岛素胎儿程序化作用的机理 2.1母体低胰岛素、高血糖环境对早期胚胎印迹基因Igf2和H19表达和甲基化的影响取糖尿病模型母鼠14天胎龄的胚胎,提取全胚胎的总RNA和DNA,检测印迹基因Igf2和H19的表达和印迹控制区(ICR)的甲基化状态。结果显示:试验组14天胚胎中Igf2 mRNA表达的相对丰度比对照组下降15.4%(P＜0.05),Real-time RT-PCR显示Igf2mRNA表达是对照组的0.65倍(P＜0.05),而H19 mRNA表达与对照组无差异。试验组Igf/H19印迹控制区的CpG甲基化率比对照组升高19.1%(P＞0.05)。提示:母体低胰岛素、高血糖环境影响早期胎儿印迹基因Igf2/H19印迹控制区CpG甲基化率,引起Igf2 mRNA表达的改变。 2.2植入前胚胎胰岛素处理对小鼠胚胎印迹基因Igf2/H19表达和甲基化的影响将小鼠2细胞胚胎培养于KSOM+0.25μg/ml Insulin的培养基内,发育至桑椹胚和囊胚,囊胚转移到假孕母鼠子宫。提取桑椹胚、囊胚和14天胚胎的总RNA和总DNA,检测印迹基因Igf2和H19的表达和印迹控制区(ICR)的甲基化状态。Real-timeRT-PCR分析表明,试验组桑椹胚Igf2 mRNA表达是对照组的4.7倍,H19表达是对照组的5.7倍;试验组囊胚Igf2 mRNA表达是对照组的1.8倍,H19表达量是对照组的2.3倍;14天胚胎,试验组Igf2和H19 mRNA表达均是对照组的1.5倍(P＜0.05)。BSP测序法分析Igf2/H19印迹控制区的甲基化水平发现,试验组桑椹胚、囊胚和14天胚胎甲基化率分别为7.3%,32.3%和46%,分别比对照组下降86.4%,35.4%和19.2%(P＜0.01)。提示:植入前胚胎暴露于胰岛素可降低Igf2/H19印迹控制区DNA甲基化的水平,从而使Igf2和H19基因表达升高。 3.基因表达谱芯片筛选与胎儿程序化作用相关的差异表达基因取糖尿病模型小鼠和对照组小鼠14胎龄的胚胎,提取胚胎的总RNA。逆转录成cDNA,将Cy3和Cy5 2种荧光分别标记到试验组和对照组的cDNA上,并与包含24859个基因的表达谱芯片进行杂交及扫描,重复3次实验,采用Agilent扫描仪进行扫描分析,软件读取数据,结果筛选出差异表达基因397个,其中有328个基因在试验组表达量比对照组大2倍,69个基因在试验组表达量比对照组小2倍,其中糖尿病相关基因Rrad(Ras-Related Associated with Diabetes)和Rasl12上调,该基因与Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗有关;Otx2 and Robo3基因下调,其主要调节脑和神经系统发育及脑细胞分化。提示:母体糖尿病环境影响早期胎儿基因表达,进而影响胚胎发育。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R587.1;R321

【引证文献】