IFN-α和IFN-γ对MHC-I类链相关蛋白A的相反作用及其机制探讨

发布时间：2018-12-13 13:46

【摘要】： 目的NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞,具有广泛的生物学功能,位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线;不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞,同时又能通过早期分泌多种细胞因子(如IFN-γ、GM-CSF和TNF-β)和趋化因子来调节获得性免疫应答,因此,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。NK细胞及其分泌的细胞因子不仅参与调节天然免疫和获得性免疫,而且参与调节造血系统的功能,在血液系统疾病,尤其是异基因骨髓移植中,在抑制和预防GVHD,促进GVT效应和促进血液和免疫系统重建方面起重要作用。同时,NK细胞对自身免疫性疾病的调节亦引起了人们的重视。因此,尽管关于NK细胞的发育分化和识别功能的研究远远滞后于T细胞和B细胞,近年来,关于NK细胞功能和调节的研究引起了人们极大的兴趣,并有了突飞猛进的发展,成为免疫学研究的一大热点。近期的研究发现,NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制性受体,NK细胞的效应功能取决于活化信号与抑制性信号的综合。抑制性受体能特异性识别靶细胞表面的MHC-I类分子并保护正常细胞不被杀伤,人的NK细胞抑制性受体主要有杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell Ig-like receptors, KIR)和凝集素样受体CD94/NKG2A,在调节NK细胞功能方面起重要作用。活化受体识别经典、非经典的MHC-I类分子或MHC-I类相关分子,在NK活化的启动方面起关键作用,其中尤为引人注目的是NKG2D,NKG2D的配基为非经典的MHC样分子MICA (MHC class I chain-related protein A)、MICB及ULBP -1,2,3,4(UL16-binding protein-1,2,3,4),这些分子在许多上皮及非上皮来源的肿瘤细胞、病毒感染细胞和受到“应激性刺激”的细胞均有表达或上调。研究表明,NKG2D的单独活化即足以刺激NK细胞的活化,并能克服抑制性受体的强势信号,因此,在NK细胞活化过程中起着举足轻重的作用。而NKG2D配体的表达水平,可能决定着NKG2D的活化与否。目前,对MICA的结构与功能,以及与疾病关系等方面的研究都取得重要进展,但对其表达调控机制的研究却很少。干扰素是机体抗肿瘤免疫应答的重要免疫调节剂。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)具有抑制病毒复制、抑制细胞增殖、抗肿瘤等多种生物学功能。II型干扰素(IFN-γ),又称免疫干扰素,是由Th1细胞和NK细胞分泌的多功能性细胞因子,是重要的免疫应答调节剂,能激活单核巨噬细胞,诱导多种细胞表达MHC I类和II类分子而增强抗原递呈,促进Th0细胞向Th1分化等。IFN-α是经典的NK细胞活化剂,已广泛用于多种实体瘤和病毒性肝炎的治疗,但IFN-γ对肿瘤的临床疗效却不尽如人意。本实验室研究发现IFN-α和IFN-γ对NK细胞受体的调节作用是相反的,IFN-α可上调活化性受体NKG2D表达,下调抑制性受体NKG2A表达,而IFN-γ的作用则恰恰相反。MICA和MICB5’侧翼区均含有一段与热休克蛋白70基因启动子热休克应答元件相似的调控序列,基因在应激条件下的诱导表达与该序列的活化有关,上调MICA表达的应激刺激亦能上调HSP70的表达。最近研究发现,IFN-α可上调HSP70的表达,而IFN-γ下调HSP70表达;IFN-α可诱导树突状细胞表达MICA分子;金属基质蛋白酶(MMPs)的剪切作用可削弱细胞膜表面MICA分子的表达,而IFN-γ可增强MMPs的剪切功能。因此推测两者可能对人肿瘤细胞NKG2D配体MICA分子的表达在多级水平存在相反的调节作用。本研究中,我们首先观察了IFN-α和IFN-γ对人宫颈癌细胞(HeLa和Caski)及血液系统肿瘤(K562和Raji)MICA表达的影响,并且观察了MICA表达的变化对NK细胞识别与杀伤的影响,以期探讨IFN-α和IFN-γ是否相反地调节了MICA的表达,并影响了肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。进一步,我们构建了pGL3/MICA-promoter萤光报告重组载体,观察了IFN-α和IFN-γ是否通过调节MICA启动子转录活性影响MICA的表达。同时,观察了IFN-γ能否通过增强金属基质蛋白酶的剪切功能而使肿瘤细胞的膜结合型MICA脱落形成可溶性MICA。从而在转录水平和翻译后水平两方面探讨MICA表达的调控机制。方法 1.RT-PCR法检测MICA mRNA的表达 2.免疫组化法鉴定MICA蛋白的表达 3.MTT法检测人外周血NK细胞对肿瘤细胞的杀伤 4.MICA启动子克隆载体的构建: 酚氯仿法提取基因组DNA,PCR法扩增MICA启动子序列,与pMD18-T连接,构建MICA启动子克隆载体,进行DNA序列测定。 5. pGL3/MICA-promoter萤光报告基因重组载体的构建:应用限制性内切酶将MICA启动子序列从克隆载体上切下来,连接到萤光报告基因载体pGL3-basic上,构建pGL3/MICA-promoter萤光报告基因重组载体。 6.MICA启动子活性的检测:以pLR-TK作为转染效率内参照,分别与pGL3-basic、pGL3-control、pGL3/MICA-promoter质粒通过脂质体共转染到肿瘤细胞中,参照双萤光报告基因系统操作手册(Promega),裂解细胞,synergy HT多功能酶标仪检测萤光素酶活性。 7. RT-PCR法检测基质金属蛋白酶及其组织抑制物的表达。 8. ELISA法检测培养上清中可溶性MICA的含量。结果 1.IFN-α和IFN-γ对肿瘤细胞MICA表达水平的不同影响RT-PCR结果显示,人宫颈癌细胞Hela和人红白血病细胞K562 MICA表达阳性,人宫颈癌细胞Caski为弱阳性,人Burkitt淋巴瘤细胞Raji为阴性。IFN-α对MICA(+)和MICA(-)肿瘤细胞MICA mRNA的表达均有增强作用;而IFN-γ则抑制MICA(+)肿瘤细胞MICA mRNA的表达。免疫组化结果显示IFN-α和IFN-γ对肿瘤细胞表面MICA分子的蛋白表达水平具有相反的调节作用。 2.IFN-α和IFN-γ影响肿瘤细胞对外周血NK细胞杀伤的敏感性IFN-α1000u/ml可明显上调MICA(+)和MICA(-)肿瘤细胞对外周血NK细胞杀伤的敏感性;IFN-γ1000u/ml则可下调MICA(+)肿瘤细胞对外周血NK细胞杀伤的敏感性。抗体阻断实验显示MICA表达水平的变化与NK细胞杀伤活性变化密切相关。 3.MICA启动子序列的克隆提取新鲜培养的HeLa细胞的基因组DNA,以MICA启动子序列的特异引物进行PCR反应,PCR产物经电泳鉴定后,与pMD18-T载体连接、酶切鉴定后测序,证实已获得的DNA为MICA启动子序列,结果与文献报道一致。 4.pGL3/MICA-promoter萤光报告基因重组载体的构建用HindIII和XhoI从克隆载体pMD18-T/MICA-promoter切下MICA启动子片段,与经相同双酶切的pGL3-basic质粒进行粘端连接。产物转化感受态大肠杆菌JM109 ,经PCR和双酶切鉴定阳性的克隆即为构建好的pGL3/MICA-promoter萤光报告重组载体。 5.IFN-α和IFN-γ对MICA启动子活性的影响用脂质体将构建好的pGL3/MICA-promoter萤光报告基因重组质粒和作为转染效率内参照的pRL-TK质粒共转染到HeLa和Caski细胞中,分别以IFN-α和IFN-γ1000u/ml诱导48h,裂解细胞,双萤光报告基因检测系统检测裂解产物中萤光素酶的活性。结果显示,IFN-α1000 u/ml诱导48h可显著提高MICA启动子转录活性,但未观察到IFN-γ对MICA启动子转录活性的影响。 6.IFN-α和IFN-γ对可溶性MICA分子释放的影响RT-PCR结果显示,IFN-γ上调基质金属蛋白酶9(MMP9)和膜型基质金属蛋白酶2(MT2-MMP)的表达,并下调基质金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)的表达,但未发现IFN-α对两者表达变化的影响。进一步用ELISA检测HeLa和K562细胞培养上清中可溶性MICA含量的变化,发现IFN-γ1000u/ml诱导48h可明显提高上清中可溶性MICA的水平。结论 1.IFN-α上调了肿瘤细胞中MICA mRNA和蛋白的表达,继而增强NK对其识别与杀伤。 2.IFN-γ下调了肿瘤细胞中MICA mRNA和蛋白的表达,继而降低NK对其识别与杀伤。 3. IFN-α通过增强MICA启动子活性而从转录水平上调MICA基因的表达。 4.IFN-γ通过增强基质金属蛋白酶的剪切作用,降低了膜表面MICA的表达。本研究首次提出了,IFN-α和IFN-γ对人肿瘤细胞NKG2D配体MICA分子的表达具有相反的调节作用,进一步探讨了两者对NKG2D受配体系统的影响的机制,为研究NK细胞杀伤机制和肿瘤免疫逃逸机制提供了依据,为促使活化性和抑制性信号的平衡向活化方向倾斜,增强机体抗肿瘤能力提供了新的策略。
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【学位授予单位】：山东省医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】