抗志贺毒素ⅡB亚基（Stx2B）单抗的研制及其亲和层析的应用

发布时间：2018-12-19 10:30

【摘要】： 肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7是一种重要的新发人畜共患传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的近30年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157：H7感染可使人产生多种并发症，其中以溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome，HUS)危害最为严重，可导致死亡。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。同时，O157：H7菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛，使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。目前，对EHEC O157：H7感染仍缺乏有效的治疗方法。临床上针对其感染主要采用抗生素治疗及相应的对症治疗。新近的研究发现，抗生素使菌体破裂，导致O157：H7菌志贺毒素(Shiga toxin，Stx)的释放水平大大提高，使用抗生素有可能加重病情，增加发生并发症的危险并引起死亡。而针对Stx的特异性抗体可能会在治疗该菌感染上，发挥较大的作用。 EHEC O157：H7主要产生两种毒素，分别称为志贺毒素Ⅰ(Stx1)和志贺毒素Ⅱ(Stx2)。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28S rRNA作用从而抑制蛋白质合成；B亚单位具有细胞结合特性，能与具有特定糖鞘脂受体(Gb_3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用。研究证实Stx2毒性强于Stx1，与溶血性尿毒综合症(HUS)等严重并发症的相关性更为密切。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基础，是理想的制备中和毒素的特异性抗体的靶抗原。同时，获得天然的Stx2是研究其毒性作用机理、筛选更有效的疫苗候选靶点、制备特异的基因工程抗体、解析其蛋白质晶体结构等的先决条件。运用单克隆抗体亲和层析法是纯化目标蛋白的特异有效途径。基于以上认识，本研究从以下几个方面进行抗志贺毒素ⅡB亚基(Stx2B)单抗的研制及其亲和层析的研究 1．抗志贺毒素ⅡB亚单位(Stx2B)单克隆抗体的制备与鉴定方法以融合蛋白EspA-Stx2B作为抗原，免疫Balb／c小鼠，以未免疫的Balb／c小鼠脾细胞为饲养细胞；运用细胞杂交瘤技术制备，运用间接ELISA法筛选产生针对Stx2B的单克隆抗体细胞株；体内诱生法产生腹水，饱和硫酸铵沉淀法初步纯化，再采用HiTrap rProtein A柱进一步纯化；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit鉴定McAb的Ig亚型，采用间接ELISA法鉴定抗体亲和常数，进行Vero细胞毒性保护试验。结果获得3株产生针对Stx2B的单克隆抗体细胞株1H9、1H10、3E5，Ig亚型分别为IgG_1κ型，IgG_(2a)κ型，，IgG_(2b)κ型，亲和力常数分别为7．36×10~8、6．94×10~8、5．85×10~8。3株单抗在体外均能中和Stx2毒素，抑制Stx2对Vero细胞的细胞毒作用，与无关抗体1D6比较，差异极显著，p0．01；同等剂量的抗体，抑制率不同，1H101H93E5，无显著差异，p0．05；50％抑制率时3株单抗的剂量约为0．2-0．3μg。结论3株细胞株产生的抗Stx2B单抗均具有一定的中和活性，中和活性最强的为1H_(10)。 2．抗志贺毒素B亚单位单克隆抗体识别表位的初步鉴定方法运用生物信息学方法，对Stx2B(1-72aa)全蛋白进行表位预测，选取Stx2B全蛋白的23aa和54aa位置作为截短位点；从EHEC O157：H7 EDL933基因组中扩增Stx2B50(23-72aa)和Stx2B54(1-54aa)，克隆于pET-22b(+)载体，转化到工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行Tris-Tricine-PAGE蛋白电泳及Western blot分析。结果McAb 1H_9和1H_(10)能够识别Stx2B和Stx2B50；McAb 3E_5能够识别Stx2B、Stx2B50和Stx2B54。结论McAb 1H9、1H_(10)识别的抗原表位位于55-72aa，McAb 3E_5识别的抗原表位位于23-54aa。 3．免疫亲和层析纯化天然志贺毒素Ⅱ(Stx2) 方法将McAb 1H_(10)与CNBr-activated Sepharose 4B填料偶联，制备免疫亲和层析柱；用丝裂酶素C诱导EHEC O157：H7 99A021表达Stx2，以其培养上清制成Stx2初提物；初提物上柱进行纯化，并用多种方法鉴定纯化产物。结果纯化后样品进行SDS-PAGE，在32KD和8KD处明显看见蛋白条带，免疫印迹、Duopath Verotoxins Kit、细胞毒性试验(CD_(50)为2pg)和动物攻毒试验(LD_(100)为5ng)鉴定出该纯化蛋白为天然Stx2。结论应用免疫亲和层析成功纯化出天然Stx2。综上所述，本研究获得了具有毒素中和活性的抗Stx2B单克隆抗体，对其抗原识别表位进行了初步鉴定，建立了免疫亲和层析方法，成功纯化出天然Stx2，为以后的研究奠定了坚实的基础。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】