细菌内同源重组构建Ad-hNGFβ腺病毒质粒

发布时间：2018-12-25 19:06

【摘要】：目的 细菌内同源重组制备含hNGFβ基因的重组腺病毒质粒,在293细胞内 包装扩增后纯化重组腺病毒。 方法 将hNGFβ外源性核酸片段插入到经Xma Ⅰ与Xba Ⅰ酶切的pBluescript Ⅱ sk(+),构建成转移质粒pBluescript Ⅱ sk(+)—hNGFβ,将其与穿梭质粒 pShuttle-CMV各自经Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,酶切产物定向重组,构建穿梭质粒 pShuttle-CMV-hNGFβ。将该穿梭质粒经Pme Ⅰ酶切后,转化含腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183,重组为pAdEasy-1-hNGFβ,经酶切鉴定正确后, 用Lipofect介导pAdEasy-1-hNGFβ转染Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hNGF β,用PCR进行鉴定。透析纯化后的腺病毒采用紫外分光光度计进行滴度测定, 测得滴度为2.24×10~(12)PFU/L。 结果 (1) 线性化的pShuttle-CMV-hNGFβ转化含pAdEasy-1的感受态细菌 BJ5183,24h后获得了30%阳性重组质粒,经酶切得到一条大于20kb的大片段和 一条4.5kb的特征性条带。(2)重组腺病毒质粒转染Ad293细胞,第15d细胞出 现病变,扩增后,经CsCl密度梯度离心获得2.24×10~(12)PFU/L的高滴度腺病毒, 经PCR鉴定正确。 结论 应用细菌内同源重组能快速构建含hNGFβ基因的重组腺病毒载体 Ad-hNGFβ,酶切鉴定,包装为高滴度的重组腺病毒Ad—hNGFβ,为hNGFβ基 因的应用研究奠定了基础。
[Abstract]:Objective to prepare recombinant adenovirus plasmid containing hNGF 尾 gene by homologous recombination in bacteria and purify recombinant adenovirus after packaging and amplification in 293 cells. Methods hNGF 尾 exogenous nucleic acid fragment was inserted into pBluescript 鈪，

本文编号：2391515