HSP65-MUC1肿瘤疫苗、HIV DNA疫苗和HIV重组痘病毒疫苗的临床前毒理学研究

发布时间：2019-01-01 14:20

【摘要】： 疫苗是使用最广泛的药物之一,不仅使天花、疟疾等某些烈性传染病得到有效的控制或消灭,而且还被应用于肿瘤、自身免疫病、免疫缺陷、超敏反应等疾病的预防和治疗。新型疫苗是采用基因工程技术和生物化学合成技术生产的,包括裸DNA疫苗、重组蛋白类疫苗、合成肽疫苗、重组病毒和细菌疫苗等。我国一直未要求对疫苗类药物进行全面的临床前毒理学研究,国际上对于疫苗的临床前安全性研究也处于探索阶段。采用何种方法研究疫苗的毒性,特别是免疫毒性一直是困扰人们的课题。为解决我国不断研制的新型疫苗在进入临床和市场前的安全性研究问题,本文选择了我国独立研发的具有自主知识产权的三种新型疫苗—热休克蛋白-多肽复合物肿瘤疫苗(重组热休克蛋白65-MUC1融合蛋白肿瘤疫苗,HSP65-MUC1)、HIV DNA疫苗(DNA疫苗)和HIV重组痘病毒载体疫苗(痘苗)作为研究对象(其中,包括以DNA疫苗和重组痘病毒载体HIV疫苗组成的复合疫苗),对其进行了免疫毒性、一般毒性以及DNA疫苗和病毒载体疫苗的生物分布研究,目的是为找出不同疫苗毒理学研究中的共性问题及特性问题,建立相应的研究方法和研究体系。在本研究采用的免疫毒性检测的方法包括:(1)免疫相关组织器官的宏观和微观病理学检查;(2)非放射性CFSE染色法检测淋巴细胞功能(3),巨噬细胞功能检查(4)流式细胞法对不同亚型淋巴细胞数量的测定(5)ELISA检测体液免疫;(6)ELISA法、细胞内染色法、ELISPOT法检测T细胞免疫(细胞因子的产生)。本研究对DNA疫苗和病毒载体疫苗建立了实时定量PCR法检测其DNA生物分布。一般毒性研究检测疫苗对机体本身的宏观毒性反应,方法包括:血液学和血清生化学检查、大体和组织病理学检查、体重、摄食量、临床症状的观察等。 HSP65-MUC1毒性的研究包括:C57BL/6小鼠单次给药毒性研究、C57BL/6小鼠反复给药毒性研究、恒河猴反复给药毒性研究。以临床研究拟用给药次数为“n”,小鼠试验采用“n+1”次给药,恒河猴采用“n+4”次给药。研究内容包括免疫毒性和一般毒性。DNA疫苗的研究包含在复合疫苗的毒性研究中,采用BALB/c小鼠反复给药研究,完全模拟临床“3针DNA疫苗prime-1针病毒载体疫苗boost”的给药方案。研究内容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。痘苗毒性研究采用BALB/c小鼠,采用“n”次给药和“n+1”次给药2种组合,研究内容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。本研究中3种疫苗主要的毒性研究结果为:(1)在小鼠和恒河猴未见与HSP65-MUC1有关的全身毒性反应和免疫毒性反应;HSP65-MUC1可以诱导较强的体液免疫和细胞免疫反应。(2)DNA疫苗和痘苗的毒性反应包括主要由痘苗引起的注射部位可逆性的局部刺激反应、以及部分血液学指标可逆性的变化;复合疫苗与两种组分分别单独使用相比,可以诱导较强的体液和细胞免疫反应。(3)组织分布研究发现DNA疫苗和痘苗在体内不会广泛分布、也不会长期残留。本研究初步建立了关于疫苗毒理学研究的主要方法和研究体系,包括(1)建立了疫苗免疫毒性检测的方法和体系:免疫相关组织器官的宏观和微观病理学检查;建立了非放射性CFSE染色法检测淋巴细胞功能的方法,采用亚型测定检测淋巴细胞数量;检测体液免疫和细胞免疫以考察相关的免疫毒性。(2)建立了免疫原性(体液免疫)和细胞免疫的监测方法。在不同的时间点监测毒性指标,便于捕捉到毒性最敏感的时期。(3)建立了3种不同的检测T细胞免疫反应(γ-IFN水平)的方法:ELISA检测细胞上清中γ-IFN水平,操作最简便,但检测灵敏毒最低,在本文肿瘤疫苗的细胞免疫检测种,效果不是很明显;细胞内染色后流式细胞法检测特定T细胞产生γ-IFN的能力,该方法操作较简单,且比ELISA方法灵敏;ELISPOT法检测单细胞水平产生γ-IFN的能力,该方法操作复杂,但灵敏度高,可以用来检测T细胞反应不强的疫苗,但因操作过程复杂,需要严格控制试验条件,否则会导致个体差异大。(4)建立了DNA疫苗和重组病毒载体疫苗的组织分布实时定量PCR检测方法。这是该类产品必须进行的研究项目,既可以得到疫苗的体内过程的信息,也可以初步预测DNA疫苗的整合风险。(5)通过HSP65-MUC1和痘苗的评价,验证了“n+1”给药次数的合理性,并且发现在肿瘤疫苗中“n+x”,即较多的给药次数并未引起免疫耐受,可以为临床的给药方案提供参考。在“prime-boost”复合疫苗的毒性试验设计方面,可以采用新的设计思路,如,压缩研究周期、采用“n”次给药方案(而不采用“n+1”)以及新的剂量设计方法。(6)由于疫苗的作用(体液或细胞免疫)通常比普通药物维持时间长,应该根据其免疫原性的特点设计较长的恢复期,通常为6～8周(普通药物一般为2周)。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】