晚期糖基化终产物诱导内皮细胞紧密连接形态学改变机制的研究

发布时间：2019-01-20 08:37

【摘要】： 目的： 晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)是一组在体内糖的醛基与蛋白质的氨基之间发生的非酶性糖基化反应的终产物的总称。有研究证明：AGEs在糖尿病血管并发症、动脉硬化、肾病、老年性痴呆症以及衰老的发生发展起重要的作用，而血管通透性升高则是AGEs所致血管病变的早期和主要的病理生理基础。然而，参与其中的机制尚未完全阐明。一般情况下，血管通透性的调节主要是通过细胞间连接以及细胞—基质间的锚定作用和内皮细胞自身的收缩产生的向心力间的动态平衡来实现的。自身收缩力增大或连接破坏都会引起血管通透性升高。内皮细胞紧密连接(tight junction，TJ)是由多种跨膜蛋白[包括咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudin-1、claudin-2、claudin-5)]、TJ相关膜周边蛋白[包括胞质带状闭合蛋白(ZO-1、ZO-2、ZO-3)，扣带蛋白(cingulin)，rab13等]和连接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)等组成的复合物。相邻细胞膜表面occludin和claudin各自同型间相互密切结合，这两种蛋白又通过包括ZO-1在内的周边蛋白与肌动蛋白相作用，形成闭锁的细胞间连接。细胞间连接的解离会导致细胞间隙的形成，从而引起内皮通透性的升高。本课题的研究目的是探讨AGEs对内皮细胞紧密连接ZO-1和纤维状肌动蛋白(Filamentous actin，F-actin)的形态学影响，并对其作用机制作初步研究，为相关疾病的发生机制提供更系统的实验数据，，为临床治疗提供新的思路。 方法： 培养人脐静脉内皮细胞，用免疫荧光染色的方法显示ZO-1和F-actin在内皮细胞分布的形态和部位。AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albumin，AGE-HSA)，由人血清白蛋白与葡萄糖共孵育8周制得。观察AGE-HSA以不同浓度(12.5、25、50、100 mg／L)和不同时间(2、4、8、24 h)作用下，内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin的形态学变化，查明AGEs引起内皮细胞ZO-1和F-actin形态改变的剂量和时间效应。通过选用Rho激酶的特异性抑制剂Y-27632探讨Rho激酶在AGEs诱导内皮细胞ZO-1和F-actin形态改变中的作用。分别使用ERK通路抑制剂PD98059、p38 MAPK通路抑制剂SB203580预处理人脐静脉内皮细胞；另外分别使用相关特异蛋白突变体重组腺病毒转染内皮细胞，来探讨ERK通路和p38 MAPK通路在AGEs介导的内皮细胞ZO-1和F-actin形态学变化中发挥的作用。以上变化通过激光共聚焦显微镜观察。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)的方法检测AGEs刺激内皮细胞对ERK和p38 MAPK磷酸化的水平的影响，为形态学结果提供进一步证明。 结果： 1．正常对照组的内皮细胞ZO-1存在于细胞周边呈环状，线条清晰连续，边缘光滑流畅。AGEs作用于内皮细胞引起ZO-1形态的明显变化，ZO-1环线条变得模糊，呈断裂状，边缘粗糙有毛刺状突起，细胞内染色增多，且这种变化的程度随着AGEs作用浓度的增加(12.5-100 mg／L)和作用时间的延长(2-24 h)逐渐加深。其中以50 mg／L AGEs作用细胞8 h变化最为明显。正常条件下F-actin分布在细胞周边形成actin环，结构紧密，边界清晰，细胞间无间隙。AGEs作用于内皮细胞导致actin环出现断裂，细胞界限模糊，此变化的程度亦随AGEs作用浓度的增加和作用时间的延长逐渐加强。 2．用Rho激酶抑制剂Y27632预处理细胞30 min后，可明显降低AGEs对紧密连接蛋白ZO-1和F-actin分布和形态的影响。 3．分别用ERK通路抑制剂(PD98059)或p38 MAPK通路抑制剂(SB203580)预处理细胞30 min后，均可显著减轻AGEs对ZO-1和F-actin的影响。 4．分别以含显性失活(dominant negative，DN)的ERK上游激酶MEK1或p38 MAPK上游激酶MEK6b的重组腺病毒预先转染内皮细胞12 h，均可减轻AGEs对紧密连接蛋白ZO-1和F-actin分布和形态的影响；而含组成型激活(constitutive active，CA)MEK1或MEK6b突变体的重组腺病毒本身作用细胞即可引起内皮细胞ZO-1和F-actin分布和形态的变化。 5．Western blot研究结果显示，50 mg／LAGEs刺激细胞8h能引起内皮细胞p38 MAPK磷酸化水平的升高。用Rho激酶抑制剂Y-27632预处理细胞30 min后，可降低AGEs诱导的内皮细胞p38 MAPK磷酸化水平的升高。 结论： 1．实验证明，AGEs以剂量和时间依赖的方式引起内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin形态和分布改变。 2．Rho激酶参与了AGEs引起的内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin形态和分布的改变。 3．AGEs刺激可以引起内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin形态和分布改变，这一作用可能是由ERK及p38 MAPK信号通路介导的。 4．AGEs可诱导内皮细胞p38 MAPK激活，而Rho激酶抑制剂Y-27632预处理细胞，可降低AGEs引起内皮细胞p38 MAPK磷酸化水平的升高，说明Rho激酶可能在p38 MAPK通路上游发挥作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R361

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张冰;程罡;王莉莉;李松;;晚期糖基化终产物靶向治疗药物与糖尿病血管内皮功能紊乱[J];中国药理学通报;2007年05期

2 郭志坚,侯凡凡,张训,刘志强,王力;晚期糖基化终产物通过p38信号通路抑制内皮细胞合成一氧化氮的研究[J];中华医学杂志;2002年19期

3 刘宏,侯凡凡,梁敏,蒋建平,张训;晚期糖基化终产物修饰蛋白刺激人血管内皮细胞表达粘附分子的研究[J];解放军医学杂志;2001年05期

4 周一军;王佳贺;张锦;;晚期糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞的肝细胞生长因子表达的影响[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2006年06期

5 周娟;张悦;陆海英;刘煜敏;;晚期糖基化终产物在糖尿病肾病中的病理作用[J];生理科学进展;2009年04期

6 郭志坚,侯凡凡,梁敏,王力,张训,刘志强;晚期糖基化终产物刺激内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1信号传导途径[J];中华医学杂志;2003年12期

7 方莲花;杜冠华;;晚期糖基化终产物和抗动脉粥样硬化药物发现策略[J];中国药学杂志;2007年11期

8 候凡凡,蒋建平,张训;人类关节滑膜细胞表达晚期糖基化终产物受体[J];中华肾脏病杂志;2000年03期

9 欧阳平,彭文烈,赖文岩,徐安龙;绿茶多酚抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖[J];中国药理学通报;2004年02期

10 徐心耕;赵晴;于明;;晚期糖基化终产物在β样淀粉蛋白25-35诱导PC12细胞氧化损伤中的作用[J];中国实验诊断学;2007年10期

相关会议论文 前10条

1 郭志坚;侯凡凡;张训;;晚期糖基化终产物通过p38通路调节内皮细胞一氧化氮的生成[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年

2 贾红亮;吕海涛;孙凌;张建敏;严文华;朱伯会;曹磊;周万平;丁粤粤;;辛伐他汀对内皮细胞释放微颗粒的影响及其机制的研究[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年

3 马向红;黄体钢;杨万松;周丽娟;;四氢生物喋呤对内皮细胞产生一氧化氮和超氧阴离子的影响[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

4 冷晔;丁祖泉;高艳琴;;剪切力对内皮细胞、内皮细胞—小肠黏膜下基质复合培养物的影响[A];第八届全国生物力学学术会议论文集[C];2006年

5 宋明宝;于学军;朱光旭;;钙离子跨缝隙连接在内皮细胞与平滑肌细胞间传递的研究[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年

6 武晓静;黄岚;赵刚;;内皮细胞表型改变对平滑肌细胞表型转换及迁移的作用[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年

7 林云锋;田卫东;陈希哲;闫征斌;乔鞠;李志勇;刘磊;郑晓辉;汤炜;;大鼠脂肪源性内皮细胞成脂潜能的研究[A];2005'中国修复重建外科论坛论文汇编[C];2005年

8 马刚;林晓曦;金云波;李伟;王维;胡晓洁;许志成;杨川;;婴幼儿血管瘤内皮细胞的分离、培养及鉴定[A];第四届华东六省一市整形外科学术会议暨2007年浙江省整形、美容学术会议论文汇编[C];2007年

9 易龙;陈春烨;金鑫;于斌;舒芙蓉;麋漫天;;人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进[A];中国营养学会第十次全国营养学术会议暨第七届会员代表大会论文摘要汇编[C];2008年

10 单志新;林秋雄;杨敏;邓春玉;朱杰宁;麦丽萍;符永恒;林曙光;余细勇;;血管紧张素Ⅱ通过AP-1调控内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子的表达[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年

相关重要报纸文章 前10条

1 吴一福;西京医院振荡法支架种植内皮细胞获成功[N];中国医药报;2008年

2 ;中药抗血栓机理及对内皮细胞的生物医学研究取得佳绩[N];科技日报;2000年

3 赵军;耳毒性药物对耳蜗螺旋动脉平滑肌和内皮细胞电生理特性的影响项目[N];科技日报;2007年

4 吴一福;PTFE血管材料可携载VEGF基因转染[N];中国医药报;2006年

5 杨茜;美学者发现抗癌药新生物指标[N];中国医药报;2006年

6 衣晓峰 李媛媛;化疗可以有另一种方式[N];健康报;2006年

7 纪英超;Tumsatatin使肿瘤细胞粮尽援绝[N];医药经济报;2002年

8 杨春;伤口暴露好还是湿敷好[N];大众卫生报;2001年

9 衣晓峰 李媛媛;晚期肺癌化疗有了低剂量给药方式[N];中国医药报;2006年

10 衣晓峰 靳万庆 本报记者　 □ 李媛媛 本报通讯员　;晚期肺癌低剂量化疗给药方式优点多[N];中国中医药报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 郭志坚;晚期糖基化终产物修饰的蛋白质对人血管内皮细胞的病理生物学作用及其机制的研究[D];第一军医大学;2002年

2 李寒;开放MitK_（ATP）通道对缺血再灌注心肌保护作用研究[D];第三军医大学;2005年

3 贾素洁;内源性一氧化氮合酶抑制物与内皮细胞通讯功能障碍及（口山）酮的保护作用[D];中南大学;2007年

4 张毅民;内皮源性降钙素基因相关肽合成与释放调节机制及其病理生理意义[D];中南大学;2010年

5 杜欢;基于络脉理论的脑微血管内皮细胞调控脑微环境的分子机制研究[D];北京中医药大学;2011年

6 邢邯英;血红素加氧酶-1对糖尿病血管病变的影响及机制初探[D];河北医科大学;2005年

7 房凯;高表达Caveolin-1抑制内皮细胞增殖的信号传递机制研究[D];中国医科大学;2005年

8 付嘉;重组人β2糖蛋白1及其第一结构域对抗磷脂抗体综合症患者血清诱导内皮细胞活化的影响及作为耐受原的初步探讨[D];吉林大学;2006年

9 杨敏;黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预研究[D];北京中医药大学;2007年

10 伍尚敏;YH-16、平阳霉素、地塞米松对血管瘤内皮细胞作用的实验研究[D];昆明医学院;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘宏;晚期糖基化终产物刺激人血管内皮细胞表达粘附分子[D];第一军医大学;2000年

2 张策;晚期糖基化终产物和D—半乳糖对内皮细胞增殖活性及其肌动蛋白的形态学影响[D];第一军医大学;2002年

3 王大鹏;VEGF及其受体FLK-1在人脑微血管内皮细胞UPR过程中的表达[D];中国医科大学;2003年

4 邰海服;单纯肥胖大鼠血管内皮损伤与血脂关系及丹皮酚的保护作用[D];安徽医科大学;2009年

5 杨小芳;促红细胞生成素预防培养人脐静脉内皮细胞凋亡的研究[D];兰州大学;2009年

6 朱红梅;肿瘤上清液诱导的正常内皮细胞与成纤维细胞的特性研究[D];重庆医科大学;2002年

7 李健;镁对培养人脐静脉内皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用的实验研究[D];青岛大学;2003年

8 胡学峰;生物陶瓷人工骨血管化的探索[D];第四军医大学;2005年

9 聂志华;胰岛素、血管紧张素Ⅱ对人血管内皮细胞NF－κB的激活和血脂康干预的影响[D];江西医学院;2005年

10 刘漪沦;K562细胞条件培养基对内皮细胞氧化还原态的影响及其在肿瘤血管生成中的意义[D];四川大学;2005年

本文编号：2411856