Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

发布时间：2019-01-21 17:13

【摘要】： 第一部分Snail真核表达质粒扩增及转染骨髓间充质干细胞的实验研究 目的:研究Snail基因在人骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染和表达,Snail对骨髓基质细胞生物学性状及生长等方面的影响,探讨骨髓基质细胞作为Snail基因受体细胞的可行性。 方法:采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对成人骨髓MSC进行纯化和体外扩增,观察细胞形态和表面标志物的表达特点,流式细胞仪检测骨髓MSC表面抗原表达,脂质体法将重组真核表达载体(pCAGGSneo-snail-HA)及对照空质粒(pCAGGSneo)转染MSCs,G418筛选稳定表达,绘制转染后细胞的生长曲线,分别于转染后48小时和4周利用免疫荧光染色技术及免疫印迹法检测MSCs报告基因HA及目的基因Snail表达情况。 结果:成人骨髓MSC培养3天后有散在呈针尖状的贴壁细胞,7~10天后形成集落或融合呈纤维状,3周左右细胞生长可汇合至80-90%,间充质样细胞呈长梭形,走向趋向一致,传代后1周左右即可融合,3~5代后基本纯化,细胞形态单一,细胞排列具有典型的旋涡状结构。流式细胞仪检测结果显示:CD34表达阴性及CD29表达阳性;500μg/ml的G418是最适筛选浓度,pCAGGSneo-Snail-HA转染后不同时期的MSCs在蛋白水平均可检测到目的基因snail及报告基因HA的表达;生长曲线示重组真核表达载体(pCAGGSneo-snail-HA)及对照空质粒(pCAGGSneo)转染后的细胞(即MSCs-Sna和MSCs-neo)生长曲线与未转染的同代MSCs相比,倍增时间稍稍延长,一代时间约比未转染的细胞多一天,而MSCs-Sna和MSCs-neo之间倍增时间及一代时间没有明显差异。 结论:分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,第3、5代细胞很纯且生长旺盛,适用于做转染或以后的研究,pCAGGSneo-snail-HA可以在MSCs内获得瞬时和长期表达,且Snail表达对MSCs的生长速度无明显影响。MSCs可以作为Snail基因的受体细胞,为下一步研究Snail对MSCs迁移趋化、存活抗凋亡及基质金属蛋白酶2分泌等生物学特性的影响奠定基础。 第二部分Snail基因修饰诱导AKT、ERK活化对骨髓间充质干细胞迁移的影响 目的:探讨Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞迁移力的影响,及磷脂酰肌醇3激酶( phosphatidylinosital3-kinase , PI-3K )、细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)及P38丝裂原活化的蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)等信号通路在Snail转染骨髓间充质干细胞迁移能力改变中的调控作用。 方法:采用免疫荧光细胞化学、Western Blot方法检测Snail基因修饰后骨髓间充质干细胞内PI3K、ERK1/2和P38/MAPK信号通路的表达变化,用跨膜迁移实验(Transwell实验)来评价MSCs的侵袭迁移能力,比较转染Snail质粒和转染对照空质粒的骨髓间充质干细胞的差异,并比较用和不用各信号通路干预剂的差异。 结果:Western blot结果表明, MSCs-Sna细胞P-ERK1/2与总ERK1/2的比值(ERK的磷酸化活性)显著高于MSCs-neo组(0.14±0.04 vs. 0.6±0.09, P0.05)。同时,MSCs-Sna细胞内p-Akt与总Akt的比值(AKT的磷酸化活性)较MSCs-neo组亦显著性增加(0.20±0.05 vs. 0.75±0.1, P0.05)。免疫荧光细胞化学染色显示P-ERK1/2、p-Akt在MSCs-neo中均为较弱的绿色荧光,且多分布在细胞胞浆内。而在MSCs-Sna中P-ERK1/2、p-Akt荧光强度明显增强,核内亦存在较多分布。p-P38在MSCs-neo和MSCs-Sna细胞核和胞浆中均呈阴性表达。Transwell体外跨膜侵袭迁移实验显示Snail质粒转染MSCs(MSCs-Sna)较对照空质粒转染MSCs(MSCs-neo)细胞迁移率增加(p0.05),PI-3K信号通路特异性抑制剂Wortmannin和ERK通路抑制剂PD98059能显著抑制此迁移率的增加(p0.05)。各浓度P38通路抑制剂SB203580对MSCs-neo和MSCs-Sna的跨膜迁移数量均无明显抑制作用(P0.05)。 结论: Snail基因修饰可增加骨髓间充质干细胞AKT、ERK1/2磷酸化水平,并促进骨髓间充质干细胞的迁移,PI3K通路的特异性抑制剂Wortmannin和ERK通路抑制剂PD98059可分别抑制Snail修饰诱导的AKT、ERK1/2的磷酸化,降低骨髓间充质干细胞迁移能力;SB203580对Snail的促细胞迁移作用无明显影响。PI3K和ERK信号通路在Snail基因促进骨髓间充质干细胞迁移功能的调控中可能发挥了重要作用。 第三部分Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞CXCR4表达水平及向SDF-1趋化能力影响的研究 目的:观察MSCs在Snail基因修饰后细胞膜表面相应特异性受体CXCR4表达水平、及对SDF-1的趋化能力的变化。为探索提高MSCs移植后向受损后局部常高表达SDF-1的器官组织趋化迁移能力的方法提供研究基础。 方法:采用免疫荧光细胞化学染色、荧光标记流式细胞仪技术及RT-PCR技术检测Snail基因修饰后的骨髓间充质干细胞上CXCR4受体的表达水平;采用体外Transwell跨膜趋化实验评价MSCs向SDF-1的趋向迁移能力,观察大小不同浓度的抗CXCR4中和抗体对趋化实验的干预作用。 结果:流式细胞仪荧光检测显示,MSCs-neo和MSCs-Sna细胞表面均有CXCR4受体的表达,其中MSCs-Sna的阳性表达率明显高于MSCs-neo的阳性表达率(64.25%±7.22% vs. 7.45%±0.91%, P0.05)。免疫荧光细胞化学检测显示CXCR4在MSCs-neo和MSCs-Sna的细胞膜上均有阳性表达,但在MSCs-neo中为较弱的绿色荧光,而在MSCs-Sna中CXCR4荧光强度明显增强。RT-PCR结果显示,以GAPDH mRNA为内参照,在MSCs-neo、MSCs-Sna细胞中都有CXCR4 mRNA的表达,但在MSCs-Sna细胞中的表达显著高于MSCs-neo(0.916±0.102 vs. 0.410±0.050,P0.05)。体外跨膜趋化迁移实验显示,MSCs-Sna在SDF-1诱导下的细胞迁移量较MSCs-neo显著增加(p0.05)。阻断性CXCR4单抗(12G5)(中和抗体)加于微孔隔离室的上室后可显著减少SDF-1α诱导的MSCs-Sna趋化运动,且10ug/ml的CXCR4单抗对SDF-1α诱导的细胞趋化运动的抑制作用较强1ug/ml的CXCR4单抗作用更为明显。同时,IgG阴性对照抗体对SDF-1α诱导的MSCs-Sna趋化运动没有抑制效应。 结论:Snail可上调MSCs趋化因子受体CXCR4分子的表达,并可通过这一环节促进骨髓间充质干细胞对相应趋化因子SDF-1的趋化作用,这提示了通过上调Snail的表达而提高MSCs向正调节表达SDF-1的受损组织(例如脑的缺血半暗带等部位)迁移效率的可行性,为提高MSCs的迁移能力及移植效率的研究方向提供了新思路和实验依据,并为以后进一步开展提高MSCs向受损组织器官迁移的在体实验研究提供了实验基础。 第四部分Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞骨架结构稳定作用及对IL-4和无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用研究 目的:观察Snail对骨髓MSCs在离体无血清培养下细胞骨架的变化及凋亡的影响,并研究Snail对MSCs在含IL-4培养基中发生凋亡的保护作用,为探索提高MSCs移植后存活能力的方法提供研究基础。 方法:MSCs-Sna及MSCs-neo于体外无血清培养基中培养后,β-Actin免疫荧光细胞染色观察细胞骨架,流式细胞仪检测细胞Sub-G1凋亡峰,及Annexin V/PI双标法检测细胞早期凋亡率(Annexin V+/PI- %),并比较snail转染及未转染的MSCs(即MSC-sna及MSC-neo)在以上方面的差异。同样的方法,MSCs-Sna及MSCs-neo在含IL-4(20ng/ml)和不含IL-4的完全培养基中培养24小时后,收集细胞流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果:无血清培养24小时后,MSCs-Sna细胞骨架排列保持正常有序分布状态,细胞长极存在较长的应力纤维束,细胞轮廓清晰;而MSCs-neo细胞骨架排列出现紊乱,基本细胞形态尚保持。无血清培养72小时后可见,MSCs-neo不能维持正常形态,轮廓模糊,萎缩成团状,细胞骨架断裂紊乱;与之相比,MSCs-Sna无血清培养72小时后尚能维持基本形态,细胞轮廓尚清晰,细胞骨架依然可见有序排列。无血清培养24小时,MSCs-Sna和MSCs-neo之间比较凋亡率没有显著差异;无血清培养72小时后MSCs-Sna Sub-G1凋亡细胞率和Annexin V+/PI-%早期凋亡率(34.33%±5.51%和12.5%±2.2%)较MSCs-neo凋亡率(52%±8.19%和30%±4.3%)低,且有统计学差异(p0.05);细胞在含IL-4(20ng/ml)和不含IL-4的完全培养基中培养24小时后,检测annexin-V+PI- %(早期凋亡率),比较MSCs-Sna和MSCs-neo凋亡率的差异:加入IL-4后MSCs-neo的早期凋亡较未加入IL-4时增高达5倍,而对于转染Snail表达载体后的MSCs(即MSCSs-Sna),加入IL-4后MSCs-Sna早期凋亡增高仅达未加入IL-4的2.6倍。 结论:经Snail基因修饰,MSCs骨架结构的稳定性及在体外无血清培养或IL-4等促凋亡因素存在的环境中抗凋亡能力增加。 第五部分Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞MMP2表达的影响及其信号传导通路的研究 目的研究Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞MMP-2表达的影响,及细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)和PI-3K/AKT信号通路在Snail转染骨髓间充质干细胞MMP-2表达改变中的调控作用。 方法应用脂质体介导的方法将携带Snail基因的重组载体pCAGGSneo-Snail-HA导入体外培养的骨髓间充质干细胞中,用G418筛选获得阳性细胞。采用RT-PCR检测细胞内MMP-2 mRNA的表达,明胶电泳酶谱分析细胞上清液中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的活力,并比较转染Snail质粒和转染对照空质粒的MSCs的差异;阻断实验以不同浓度ERK激酶特异性抑制剂(PD98059)或和PI3K通路特异性抑制剂(Wortmannin)干预后Western-blot检测MSCs细胞ERK、AKT磷酸化水平变化,确定PD98059和Wortmannin分别抑制Snail诱导的MSCs细胞ERK激酶和AKT激酶磷酸化的有效浓度,进而研究其对Snail转染MSCsMMP-2 mRNA水平及培养上清中MMP-2活性的影响。 结果:(1)Western blot分析显示MSCs-Sna细胞p-Akt和p-ERK水平较MSCs-neo均明显增高;Wortmannin和PD98059可分别以剂量依赖性抑制MSCs-Sna细胞p-Akt和p-ERK水平;可有效抑制Snail诱导的MSCs细胞ERK激酶及AKT激酶磷酸化的PD98059和Wortmannin相应浓度分别为50μmol/L和40 nmol/L。(2)以GAPDH mRNA为内参照,RT-PCR结果显示,MSCs-Sna细胞中MMP-2 mRNA的表达显著高于MSCs-neo(0.680±0.104 vs. 1.803±0.301,P0.05);PD98059(50μmol/L)、Wortmannin(40 nmol/L)明显抑制了Snail修饰诱导的MMP-2 mRNA水平,抑制率分别为33%和30%;而两者联合给予对MSCs-Sna细胞MMP-2基因表达的抑制作用具有协同作用,抑制率为56%,与MSCs-Sna组相比,差异有统计学意义(0.803±0.160 vs. 1.807±0.304, P0.05)。(3)明胶酶谱实验显示MSCs-Sna有较高水平MMP-2活性,为对照组(MSCs-neo)的1.79±0.22倍(p0.05);而在50μmol/L PD98059作用后下降至(1.28±0.12)倍(P0.05);在40 nmol/L Wortmannin作用后下降至(1.24±0.21)倍(P0.05);PD98059与Wortmannin联合干预后下降至(0.98±0.23)(P0.05);而SB203580处理对MSCs-Sna细胞MMP-2活力的影响无显著性差异(P0.05)。 结论Snail能促进MSCs的MMP-2的转录及MMP-2蛋白的表达。MMP-2可能是MSCs的细胞内受转录因子Snail调控作用的耙基因之一,且ERK1/2及PI3K转导通路的激活在此过程中具有调控作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329.2

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本文编号：2412850