真核共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的构建及表达

发布时间：2019-03-07 16:38

【摘要】： 背景与目的： 黑色素瘤抗原(Melanoma antigen，MAGE)是从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关性抗原(tumor-associated antigen，TAA)。MAGE是一类超家族抗原，主要包括四个亚家族：MAGE-A，，MAGE-B，MAGE-C和MAGE-D，其中MAGE-A又包含MAGE-1至MAGE-12共12个基因。近年来，大量国内外文献均报道MAGE-1基因在肝癌、食管癌、胃癌、舌癌、白血病、头颈癌、肺癌、神经母细胞瘤等常见肿瘤中都有较高的表达率，在正常组织中MAGE-1只表达于睾丸和胎盘，而睾丸和胎盘是免疫豁免组织，不会受到免疫活性细胞的攻击。因此，MAGE-1在肿瘤中表达的广泛性和相对特异性使其具有很好的应用前景并以此成为研究的热点。迄今为止，已发现8个由MAGE-1基因编码的HLA-Ⅰ类分子限制的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位，MAGE-1可以激活免疫系统中的前体T细胞形成特异性的CTL，CTL通过识别肿瘤表达的MAGE-1抗原特异性的杀伤肿瘤细胞，这一结果为MAGE-1的应用提供了有力的实验依据。研究表明，在肿瘤抗原的特异性识别过程中，B7作为T细胞活化的共刺激信号，具有促进T细胞增值，抑制T细胞凋亡，增强T细胞对抗原的敏感性，介导T、B细胞的黏附，促进体液免疫应答。大多数肿瘤细胞表面不表达B7分子(B7-1或B7.2)或表达水平很低，致使第二信号通路受阻，无法诱导特异性CTL的产生，将B7.2分子的cDNA导入肿瘤细胞则能诱导抗肿瘤免疫应答。目前，有关B7.2在肿瘤免疫治疗中的应用研究已有很多，Vasilevko等构建MUC1粘蛋白(简称MUC1)和B7.2的共表达载体，以基因枪的方式免疫小鼠然后接种表达MUC1的乳腺癌细胞系，可以延长成瘤时间，抑制肿瘤生长。Disis的研究结果表明，编码neu(编码具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白)的和B7.2的质粒经皮下注射，可以诱发neu特异性的细胞和体液免疫反应，发挥抗肿瘤作用。但将B7.2与MAGE-1基因融合构建真核共表达质粒，使得MAGE-1和B7.2能够在同一细胞中同时表达，执行协同抗肿瘤免疫效应，还未见报道。本课题选用MAGE-1及B7.2基因片段，以pEGFP-C3质粒为载体，构建pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表达载体，并通过脂质体介导转染人食管癌细胞株EC9706，观察其表达，以获得绿色荧光真核共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1，旨在为进一步探讨以MAGE-1为靶点的肿瘤主动免疫治疗提供实验基础。 方法： 1．真核共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的构建：参照GenBank收入的B7.2及MAGE-1基因序列，应用Oligo 6.0基因分析软件分析设计PCR引物，并在每条引物前分别加上限制性酶切位点。用RNA提取试剂盒分别从乳腺组织、乳腺癌组织中提取总RNA。用RT-PCR方法，扩增目的基因B7.2和MAGE-1片段。然后用胶回收试剂盒纯化PCR产物B7.2基因片段和MAGE-1基因片段，并分别与载体pGEM-T Easy连接。将构建的pGEM-T-B7.2用质粒纯化试剂盒提取，再用XhoⅠ、SalⅠ内切酶将B7.2从质粒上切取、胶回收纯化后，与用XhoⅠ、SalⅠ酶切过的pEGFP-C3真核表达质粒连接。分别将构建的pGEM-T-MAGE-1、pEGFP-C3-B7.2质粒用KpnⅠ、SalⅠ内切酶消化，胶回收双粘MAGE-1和双粘pEGFP-C3-B7.2，用T4DNA连接酶连接，构建的pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表达载体经PCR、酶切和测序鉴定。 2．人B7.2/MAGE-1转染食管癌EC9706细胞：应用脂质体转染技术，将重组质粒pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1转染EC9706细胞，24h后在荧光倒置显微镜下观察融合基因的表达情况。G418加压筛选20d，获得稳定表达融合基因的EC9706细胞，用RT-PCR在mRNA水平检测B7.2/MAGE-1基因的表达。 结果： 1．通过RT-PCR扩增获得B7.2目的基因片段(119-719)，加上两端内切酶位点为618个碱基对；通过RT-PCR扩增获得MAGE-1目的基因片段(626-1159)，加上两端内切酶位点约545个碱基对。 2．成功构建了pGEM-T-B7.2及pGEM-T-MAGE-1原核重组载体，B7.2及MAGE-1基因的测序结果与GenBank公布的一致。 3．成功构建了pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表达载体，经PCR和XhoⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定其目的片段大小与预期的一致。 4．建立了稳定表达B7.2/MAGE-1的EC9706细胞系，经荧光显微镜观察，转染24h后细胞内发出绿色荧光；用RT-PCR在mRNA水平检测B7.2/MAGE-1基因的表达，其大小与预期的一致。 结论 1．本研究成功构建了MAGE-1与B7.2真核共表达载体。 2．本研究获得了能稳定表达MAGE-1和B7.2的EC9706细胞。 3．本研究为进一步探讨以MAGE-1为靶点的肿瘤主动免疫治疗提供了重要的实验基础
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

【参考文献】

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本文编号：2436272