【摘要】： 抗体技术经历了多克隆抗血清,单克隆抗体,发展到基因工程抗体阶段,其最突出的发展是噬菌体抗体库技术的建立。传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体费时费力,噬菌体抗体库技术的出现使抗体的制备产生了突破性的进展。噬菌体抗体库是以丝状噬菌体为载体,用分子克隆的方法将外源性基因插入噬菌体衣壳蛋白(pⅢ,pⅧ等)基因中,制备有扩增能力且能在表面表达某一种抗体的融合噬菌体(fusion phage),进而经过几轮吸附—洗脱—富集后,可获得大量目的噬菌体,最终获得具有特异结合性质的抗体,并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。由于噬菌体抗体库技术绕过细胞杂交这一步,避免了杂交瘤细胞系不稳定的缺点,较好地解决了人体杂交瘤系统低效的难题,为人类单克隆抗体的制备开辟了广阔的前景,故被认为是继杂交瘤抗体之后的第三代抗体。虽然噬菌体抗体库技术应用时间较短,但在肿瘤的诊断和治疗、抗原表位分析、药物设计等多个领域显示出了巨大的发展潜能和广阔的应用前景。 本研究旨在利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库,以期获得抗日本血吸虫的人源化的抗体。首先,我们用对血吸虫感染具有一定抗性成年人的血清免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,获得阳性克隆的核苷酸进行序列测定,并根据序列测定结果,选取其中一个具有完整开放阅读框架的SPI(丝氨酸蛋白酶抑制剂),设计引物,PCR体外扩增,并将其克隆,表达,纯化,用于噬菌体抗体库的筛选。其次,利用RT-PCR方法从上述成年人的外周血淋巴细胞提取总RNA、分别扩增出人IgG轻链和重链Fd段基因片段,将其克隆入PComb3中,转化入XLI-Blue,经辅助噬菌体M13K07超感染,构建滴度为6.2×1011/L,库容量为1.2×107的人源性Fab段噬菌体抗体库,并用限制性内切酶酶切、序列分析、DOT-ELISA以及SDS-PAGE等方法对噬菌体抗体库进行鉴定,结果显示成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab噬菌体抗体库。然后我们再用纯化的基因重组日本血吸虫SPI蛋白,对噬菌体抗体库进行5轮的富集筛选,经ELISA实验鉴定,结果表明筛选得到人源化特异性抗日本血吸虫SPI抗体。 本实验取得的结果显示以人的外周血淋巴细胞成功构建了人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库并获得了人源性抗日本血吸虫SPI抗体,为进一步研究这些抗体的免疫学特性、生物学活性和功能奠定了基础。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392
【参考文献】
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