中国人肠道产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶和草酰辅酶A脱羧酶基因的克隆及其在真核细胞中的表达研究

发布时间：2019-04-11 15:15

【摘要】：目的:草酸(Oxalic Acid, Oxalate)是机体不能进一步分解代谢的终产物,对组织细胞具有一定的毒性。一般情况下,来自于机体代谢的内源性草酸(主要在肝脏内合成)和肠道从食物中吸收的外源性草酸(包括草酸前体物质)均以草酸原形形式从尿中排泄。肝脏合成的异常增加和肠道的高吸收是高草酸尿的发病基础。产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes, Ox.F)是一种定居于脊柱动物肠道,与宿主形成共生关系的正常菌群(flora),具有分解草酸、调节外源性草酸吸收的功能。甲酰辅酶A转移酶基因(frc)是Ox.F分解草酸的关键酶基因之一。本研究通过真核表达载体克隆产甲酸草酸杆菌frc基因,以探讨重组frc基因能否在在真核细胞中表达,为高草酸尿的基因治疗奠定基础。 方法:提取中国人肠道产甲酸草酸杆菌的基因组DNA,用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术从产甲酸草酸杆菌基因组DNA中扩增frc基因片段并插入真核表达载体pEGFP-C1,获取重组质粒pEGFP-frc,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染人胚肾293细胞,通过逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)分别从mRNA和蛋白水平检测frc基因在真核细胞中的表达。被转染细胞在含草酸培养液中培养,检测0~72h培养液中草酸浓度的变化。 结果:中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因全长1287bp,存在53个碱基和4个氨基酸残基的变异,与GenBank中的frc基因的碱基序列的同源性为95.88%,氨基酸残基序列的同源性为99.07%。转染HEK293细胞后24~72小时,可观察到明亮的绿色荧光,RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平上检测到frc基因在真核细胞中的表达。转染pEGFP-frc细胞12~72h培养液中草酸浓度明显低于转染空载体的细胞(P0.05)。 结论:中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可分离出frc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因存在一定的变异;frc基因可在真核细胞HEK293细胞中表达并使HEK293细胞获得代谢草酸的能力。 目的:草酸(Oxalic Acid, Oxalate)是机体不能进一步分解代谢的终产物,对组织细胞具有一定的毒性。一般情况下,来自于机体代谢的内源性草酸(主要在肝脏内合成)和肠道从食物中吸收的外源性草酸(包括草酸前体物质)均以草酸原形形式从尿中排泄。肝脏合成的异常增加和肠道的高吸收是高草酸尿的发病基础。产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes, Ox.F)是一种定居于脊柱动物肠道,与宿主形成共生关系的正常菌群(flora),具有分解草酸、调节外源性草酸吸收的功能。草酰辅酶A脱羧酶基因(oxc)是Ox.F分解草酸的关键酶基因之一。本研究通过真核表达载体克隆产甲酸草酸杆菌oxc基因,以探讨中国人肠道产甲酸草酸杆菌(Ox.F)草酰辅酶A脱羧酶基因(oxc)的分离、克隆及其在293细胞中的表达,为高草酸尿的基因治疗奠定基础。 方法:提取中国人肠道Ox.F的基因组DNA,PCR扩增oxc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP-C1,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定基因片段。将重组质粒脂质体转染至人胚肾293细胞,通过逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)分别从mRNA和蛋白水平检测oxc基因在真核细胞中的表达。 结果:中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因全长1707bp。与GenBank中的序列比较,存在109个碱基的变异,同源性为93.61%,由于密码子的简并性,表达产物将出现16个氨基酸残基的变异,同源性为97.18%。重组质粒转染293细胞后24~48h,可观察到明亮的绿色荧光,从mRNA和蛋白水平上可以检测到oxc基因在真核细胞中的表达。 结论:中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出oxc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因存在一定的变异;oxc基因可在真核细胞293细胞中表达。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346;R696
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本文编号：2456515