PTEN在正常成年大鼠中枢神经系统的表达及脑缺血损伤对PTEN、p-Akt表达的影响

发布时间：2019-05-14 16:40

【摘要】： PTEN是近年来新确定的唯一具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,是p53后时代最重要的抑癌基因。PTEN定位于常染色体10q23.3,具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性。现已证实,在多种人类的恶性肿瘤,包括脑胶质母细胞瘤、黑素瘤、子宫内膜癌、前列腺癌等都存在着PTEN基因的突变或缺失。PTEN主要通过PI3K/Akt、FAK、MAPK三条信号通路发挥作用,调节细胞生长、凋亡、迁移和转化。研究发现, PTEN在负性调节神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)的增殖、促进神经细胞的分化以及突触的正确建立、协调室管膜下区(Subventricular zone ,SVZ)前体细胞增殖、凋亡和迁移之间的平衡中具有重要作用,其缺失易导致神经发育障碍。对脑PTEN的首次报道是来自于人活体组织检测,检测发现PTEN在神经元胞体,尤其是胞核有强免疫染色。此外在大鼠脊髓、体外培养的小脑颗粒细胞,以及成年小鼠嗅球、大脑皮层、基底前脑、海马、杏仁体、小脑都可以观察到PTEN的表达,提示PTEN在中枢神经系统(Central nervous system, CNS)中具有重要作用。但目前对于PTEN在正常成年CNS的表达和功能并未见比较系统的报道。 Akt,又称蛋白激酶B (protein kinase B, PKB),是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,广泛表达于体内各组织。研究表明,Akt能在生长因子,如胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)和神经营养因子的刺激下经过磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)依赖的磷酸化而被激活,其功能涉及细胞营养代谢、细胞存活与生长、细胞凋亡、细胞周期调控、血管形成等诸多方面。在细胞存活信号通路中磷酸化Akt(p-Akt)通过作用于BAD、Caspase-9、GSK-3、CREB、Forkhead转录因子、NF-κB等下游靶分子,从多途径发挥其生物学作用。脑缺血损伤是神经系统的多发病之一,常导致迟发性神经元死亡(Delayed neuronal death, DND),而DND又与细胞凋亡密切相关,其涉及机制较为复杂,发生的病理生理过程主要包括能量代谢紊乱、氧自由基产生、Ca2+超载、启动凋亡与坏死、激活抗损伤因素等。研究显示,p-Akt在脑缺血损伤中具有重要的神经保护作用,它能通过PI3K/Akt信号通路抑制细胞凋亡、促进细胞存活。研究报道,p-Akt的表达在某些脑缺血模型的神经元中呈双向变化,在另一些模型的星形胶质细胞中则持续上调。PTEN与PI3K作用相反,能降低PIP3的水平,从而降低Akt活性,促进细胞凋亡。在不同的脑缺血模型中其表达变化规律和发挥作用的细胞类型也具有差异性。那么两者在急性不完全性全脑缺血模型中的表达如何?作用的细胞类型?PTEN/Akt信号通路在其中是否发挥了重要作用?目前未见相关研究报道。因此,本研究首先以正常成年大鼠为研究对象,采用免疫组织化学方法观察PTEN在正常成年大鼠CNS中的表达模式,然后在此基础上建立大鼠急性不完全性全脑缺血模型,应用western blot和免疫组织化学技术观察PTEN和p-Akt在脑缺血再灌注不同时间点在大脑的表达情况,期望为进一步阐明PTEN和p-Akt在脑缺血损伤中的调控机制积累更丰富的资料。所得主要结果如下: 1. PTEN阳性反应产物广泛分布于大鼠的CNS内,包括端脑、大脑、间脑、脑干、小脑和脊髓。(1)在不同核团PTEN阳性细胞的分布是不均匀的,主要出现较多、中等量和少量三种情况。(2)多数阳性细胞胞体较大,呈锥形、梭形或椭圆形,染色较深。(3)在细胞内的分布包括胞体、胞核和胞体突起;胞体和胞核;胞体和胞体突起。(4)PTEN与GFAP、APC的共表达情况:大部分PTEN阳性细胞与GFAP阳性的星形胶质细胞及APC阳性的少突胶质细胞没有共表达。结果提示:(1)PTEN可能参与了CNS的多种功能,对维持CNS的正常活动具有重要作用。(2)PTEN在不同核团的不均匀分布可能与核团本身的相对细胞数量以及脑区的功能有关。(3)PTEN在细胞内的分布不同一方面可能是由于细胞类型的不同,一方面可能是由于不同定位涉及的信号通路不同,除了PI3K/Akt信号通路外,PTEN还可能通过FAK、MAPK等不同的信号通路发挥其调节作用。(4) PTEN可能主要在神经元中表达,其在胶质细胞的缺失可能和神经胶质瘤的发生发展有关。 2.PTEN、p-Akt在不完全性全脑缺血再灌注模型的表达特点如下:(1)PTEN在各时间点的表达都较强,且随再灌注时间持续缓慢上调。(2)p-Akt在假手术对照组的表达很弱,在再灌注后表达逐渐增强,3d达顶峰,之后逐渐下降。(3)p-Akt在细胞内分布的改变:在对照组,主要在胞体、突起中表达,缺血后除在胞体、突起中表达外,在胞核中的表达增强。(4)PTEN在大脑皮质、尾壳核和丘脑以及p-Akt在大脑皮质、隔核和嗅结节的表达变化程度是不一致的。(5)荧光双标结果:PTEN、p-Akt阳性细胞和GFAP、APC阳性细胞几乎没有共表达,说明两者在该模型中可能主要在神经元中表达。结果提示:(1)PTEN/Akt信号通路在该脑缺血模型中可能具有促进细胞存活、抑制凋亡的神经保护作用。除了PI3K/Akt信号通路,PTEN还可能通过其他途径发挥调控作用。(2)p-Akt活性的双向变化可能与机体和细胞内源性神经保护反应以及细胞损伤有关。(3)p-Akt在细胞内分布的改变可能是由于其作用的底物定位于胞核内。(4)PTEN和p-Akt在脑区不同部位的表达变化程度不一致可能是由于不同部位对缺血的敏感度不同。(5)PTEN、p-Akt在不同模型中作用细胞类型的差异性可能是由于采用的动物模型以及观察的部位不同所致。总之,本实验从蛋白水平观察了PTEN在正常成年大鼠CNS的表达模式以及脑缺血损伤对PTEN、p-Akt表达的影响,结果提示PTEN/p-Akt信号通路在该脑缺血模型中可能发挥了作用,为进一步研究PTEN和p-Akt在脑缺血损伤中的调控机制以及寻找新的治疗途径提供基础实验资料。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

【参考文献】