HCMV体外感染鼠胚成纤维细胞与感染复数相关性的实验研究

发布时间：2019-05-16 05:08

【摘要】： 目的:研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在体外可以增殖性感染鼠胚成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MF),探讨HCMV体外增殖性感染MF细胞与感染复数(multiplicity of infection,MOI)的相关性,为HCMV跨种属感染的分子机制研究奠定实验基础。 方法:HCMV AD169毒株复苏感染人胚成纤维细胞(human embryo fibroblast,HF),连续传代三次,待细胞病变效应(cytopathic effect ,CPE)达“4+”时,反复吹打使病毒释放,4℃3 000 rpm离心10 min,收获上清;部分上清作PFU试验测定病毒滴度,其余冻存于-80℃冰箱;设定MOI为0.1、1、10和100,根据测定出的病毒滴度和细胞计数,算出各MOI所需病毒量,分别接种至6孔培养板对应的MF细胞和HF细胞上,置5% CO2温箱37℃培养,次日换维持液,逐日镜下观察HCMV特征性CPE;分别在第1、2、5、7、10和14 d收集细胞和培养物上清,进行下列各项实验:(1)培养物上清采用PFU试验检测其中的病毒滴度;(2)收集的细胞用于进行RT-PCR半定量检测HCMV IE和UL83基因mRNA的转录水平;(3)第14 d后的细胞培养物用于抽提DNA基因组,行PCR检测HCMV UL83基因验证病毒;(4)采用透射电镜观察不同MOI感染的MF和HF细胞内有无疱疹病毒样病毒颗粒形态特征,在细胞内的分布和定位以及感染的MF和HF细胞超微结构变化与MOI的关系。 结果:以MOI为0.1和1感染MF和HF细胞时,MF细胞在2周的培养过程中没有观察到CPE的产生,HF细胞分别在第10 d和第7 d出现了较为明显的特征性CPE,光镜下观察可见部分细胞肿胀、变圆、折光性增强等特征;以MOI为10和100感染MF和HF细胞时,MF细胞分别在第7 d和第5 d出现了明显的特征性CPE,HF细胞分别在第5 d和第3 d出现了明显的特征性CPE,光镜下所见同前。随着时间的延长,细胞病变明显加重,颗粒状物越来越多,CPE扩展至整个单层细胞。MOI为0.1和1感染MF细胞后各时间点的培养物上清经PFU试验测定,均在第1和2 d的取样中检测到病毒的滴度很低,其他5个时间点未检测到空斑形成。MOI为10和100感染MF细胞后各时间点的培养物PFU测定结果显示:MOI为100时感染MF细胞,第1 d培养物上清中病毒滴度为5.8×101PFUs/ml,第2 d病毒滴度增高到1.5×102 PFUs/ml,在感染的第5 d病毒度的滴度高达2.1×105 PFUs/ml,等到感染的第10 d时,病毒的滴度达到了高峰,为1.2×107 PFUs/ml,接下来随着病变细胞的死亡病毒滴度开始下降,到第14 d病变细胞完全脱落死亡时,病毒滴度降为3.4×105 PFUs/ml,这与在镜下观察到出现特征性CPE的时间基本一致。MOI为10时病毒滴度的变化趋势和MOI为100时基本一致,但MOI为10时,在第14 d时MF病变细胞并没有完全死亡脱落。而与MF平行设置的HF细胞对照中,四个MOI中PFU试验均可检测到空斑的形成且病毒滴度随时间的延长逐渐增高,直到病变细胞死亡后病毒滴定开始下降;MOI为10和100时,病毒滴度的递增趋势与HF平行对照中检测的结果相类似。本研究中,对四个MOI第14 d后的培养物用PCR进行了验证,MOI为0.1,1,10和100时均可在766bp处扩增出HCMV UL83基因的特异性条带。RT-PCR半定量检测结果显示:MOI为0.1和1时,未检测到HCMV IE和UL83 mRNA的转录;而MOI为10和100时均检测到了HCMV IE和UL83 mRNA的转录且转录水平随着时间的推移呈递增趋势,直逐渐达高峰,随后呈下降趋势。透射电镜观察结果:在MOI为0.1和1时,电镜观察MF细胞内和细胞外未见疱疹样病毒颗粒;而MOI为10和100时,在透射电镜下可见MF细胞内有疱疹样病毒颗粒存在。 结论:(1)本研究通过PFU试验准确测定感染HCMV后MF细胞培养物上清中的病毒滴度,证明了HCMV可以在体外培养的MF细胞上增殖性感染;(2)以不同MOI感染MF细胞,通过PFU试验测定和分子生物学水平的检测,确定了增殖性感染与病毒MOI存在正相关性。
[Abstract]:Objective: To study the relationship between human cytomegalovirus (HCMV) and human cytomegalovirus (MF) in vitro. The experimental basis was laid for the study of molecular mechanism of HCMV cross-species infection. Methods: The human embryonic fibroblasts (HF), which were infected by HCMV AD169, were serially passaged for three times. When the cytopathogenic effect (CPE) reached the "4 +", the virus was released and centrifuged at 3 000 rpm at 4 鈩，

本文编号：2478038