晚期糖基化终产物单克隆抗体的制备

发布时间：2019-05-21 11:00

【摘要】： 研究目的:为建立检测血清中晚期糖基化终末产物(AGEs)浓度的微量测定技术,为糖尿病慢性并发症的诊断、治疗及预后评估提供依据,本研究试图制备抗人AGEs单克隆抗体。 研究方法:D-葡萄糖和人血清白蛋白(HSA)溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中,37℃恒温孵育12周,同时以不含D-葡萄糖的HSA为对照。12周后透析凝胶过滤纯化,荧光测定、蛋白定量及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳鉴定。取100μg纯化后的第一峰AGE-HSA加等体积福氏佐剂免疫Babl/c小鼠,共3次,用聚乙二醇(PEG)行细胞融合,用杂交瘤细胞选择性培养基次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT)及次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)选择性培养,间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选培养上清,包被的抗原为纯化后的第一峰AGE-HSA,选择对AGEs阳性,对HSA阴性的多克隆孔进行亚克隆,间接ELISA筛选亚克隆板孔的细胞培养上清。收集阳性单克隆细胞株,注射Babl/c小鼠制备腹水,经固相化甘露聚糖结合蛋白(MBP)柱纯化腹水。行亚型鉴定,并通过间接ELISA、western blot对抗体行特异性鉴定,并进行染色体鉴定。 结果:D-葡萄糖和HSA孵育12周后,反应液呈棕色,SDS-PAGE示分子量大于HSA的葡萄糖-HSA偶联产物,荧光测定表明产物系AGEs。经Sephadex G-200纯化后,得到高分子量和低分子量的两个蛋白峰,分别称为第一峰和第二峰。第一峰作为免疫原,免疫Babl/c小鼠后血清滴度大于1:106,细胞融合后筛选,获得阳性多克隆,经亚克隆,得到5株阳性单克隆细胞株。染色体鉴定示其染色体为106条。扩增5株细胞株,注射小鼠腹腔产生腹水,亚型鉴定为IgM型,抗体特异性鉴定示对AGE-HSA有特异性。 结论:获得抗人AGE-HSA单克隆抗体细胞株5株,抗体亚型为IgM型。
[Abstract]:Objective: To establish a micro-assay for detecting the concentration of advanced glycation terminal product (AGEs) in serum, and to provide the basis for the diagnosis, treatment and prognosis evaluation of the chronic complications of diabetes. Methods: D-glucose and human serum albumin (HSA) were dissolved in phosphate buffer (PBS), incubated at 37 鈩，

本文编号：2482056