N-糖链在hpIgR高表达致MDCK细胞恶性转化过程中作用的研究

发布时间：2019-05-27 02:30

【摘要】： 多聚免疫球蛋白受体(polymeric Ig receptor, pIgR)是免疫球蛋白超家族中的一员,作为特异性受体介导pIgA/pIgM的跨膜转运,它主要位于几种腺上皮细胞如肝细胞、乳腺细胞和某些物种肝细胞的细胞膜上、粘膜上皮细胞如胃肠道、呼吸道上皮细胞等。研究表明,在胃癌、子宫内膜癌、鼻咽癌、结肠癌和肺腺癌等肿瘤组织中,pIgR都是呈现异常变化的,并且随着癌变程度的不同在数量表达上也出现不同。这提示pIgR与肿瘤有着密切的联系。 糖链作为生物信息分子参与了胚胎的生长发育、细胞间的信号转导及分子识别过程,具有重要的生理功能,而且在许多重大疾病,如肿瘤、神经退行性疾病等的发生发展过程中,都有糖类物质的参与。人多聚免疫球蛋白受体(human polymeric Ig receptor, hpIgR)是一种高度N糖基化的蛋白,包含高达25%的碳水化合物,含有七个N-糖基化位点。实验室前期实验证实:高表达hpIgR的MDCK细胞出现了明显的上皮细胞-间质细胞转化(EMT)现象。而EMT在多种上皮细胞来源的恶性肿瘤侵袭转移过程中发挥了重要作用。但hpIgR上高达25%的N-糖链是否在以上谈及的肿瘤发生、发展过程中发挥作用却没有报导。基于此,本实验采用定点突变的技术获得N-糖基化位点突变的hpIgR基因片段,真核转染MDCK细胞株,获得稳定表达各突变体的细胞株,然后观察转染了各突变体细胞在增殖、迁移、侵袭等细胞行为学方面的变化,进而探讨了hpIgR上的糖链对hpIgR高表达致MDCK细胞恶性转化过程中的作用。 1 N糖链缺失的hpIgR高表达MDCK细胞株的构建及鉴定 1)获得人多聚免疫球蛋白受体pcDNA3.1-hpIgR质粒后,采用定点突变技术首先构建了七个单N-糖基化位点突变型质粒pcDNA-cmyc-hpIgR并测序验证成功,用于下步构建两个N-糖基化位点同时突变的质粒。以构建成功的单点突变体为模板,进一步采用定点突变的方法,构建了四个双糖基化位点突变型质粒pcDNA-cmyc-hpIgR并测序验证构建成功,可以用于下步MDCK转染双糖基化位点突变型质粒pcDNA-cmyc-hpIgR的实验。 2 )运用脂质体介导的真核细胞转染方法将N-糖基化位点突变的pcDNA3.1-cmyc-hpIgR稳定转染MDCK细胞,获得突变型hpIgR高表达细胞株;稳定转染pcDNA3.1-cmyc空质粒作为对照,G418筛选出稳定克隆。采用Western blotting、免疫细胞化学法鉴定转染效果及hpIgR表达,结果显示细胞内有大量目的蛋白表达,表明转染成功。 2 N糖链缺失对高表达hpIgR的MDCK细胞影响的研究 利用上述构建成功的四种缺失不同位置N-糖链的hpIgR高表达MDCK细胞,应用SRB法检测了各突变体细胞株的增殖能力,应用划痕法检测了突变体细胞株的迁移能力,应用铺有Matrigel的Transwell小室检测了细胞的侵袭能力,应用共聚焦显微镜检测了细胞骨架F-Actin和E-cadherin在各细胞株的表达,应用Western blotting检测了细胞内磷酸化的Erk1/2的情况。实验结果表明:hpIgR胞外各Domain内的N-糖链缺失并没有明显影响细胞的增殖;但Domain4和Domain5的N-糖链缺失却比较明显的影响了细胞的侵袭能力;而Domain4和Domain5的N-糖链缺失对迁移能力影响较大,并且还影响细胞骨架肌动蛋白F-actin重排和E-cadherin的含量,但磷酸化ERK1/2并没有明显的变化。以上结果显示hpIgR胞外Domain4和Domain5的N-糖链在高表达hpIgR致MDCK细胞向恶性细胞转化过程中起到非常重要的作用。 综上所述,采用定点突变、脂质体转染等不同实验手段获得了N糖链缺失的hpIgR高表达MDCK细胞株,并且发现hpIgR胞外Domain4和Domain5区域内的N-糖链在高表达hpIgR致MDCK细胞向恶性细胞转化过程中起到非常重要的作用。这为研究hpIgR糖蛋白上的糖链生物学功能提供了重要依据,也为糖生物学的研究提供了理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392;R730.2

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本文编号：2485831