【摘要】： 人类白细胞抗原-G(humanleukocyteantigen-G,HLA-G)是位于人第六号染色体短臂上的一群紧密连锁基因群,HLA-G属于非经典HLA-I类分子,是表达于母胎界面滋养层的HLA-I类基因,是重要的免疫耐受分子。主要有3个特点:选择性组织分布;有限的分子多态性;mRNA选择性剪接形成不同的异构体分子,分别编码不同的蛋白质分子亚型。HLA-G编码基因及分子结构与经典HLA-I类分子相似。早期认为HLA-G限制性表达于正常妊娠时母胎界面的绒毛外细胞滋养细胞,现已发现HLA-G蛋白还表达于胎儿绒毛膜绒毛的血管内皮细胞、羊水、绒毛基底层的增殖性细胞滋养层细胞及胸腺上皮组织等部位。HLA-G这种独特的表达方式对于维持正常妊娠有着重要的作用,育龄妇女HLA-G基因表达异常会引起不孕、习惯性流产、妊娠高血压疾病等病理性妊娠。近来发现,HLA-G分子还能抑制NK细胞、T细胞的细胞溶解作用、诱导CD8+T细胞凋亡,以及调节细胞因子的释放,进而影响机体免疫反应。因此,HLA-G是人类生殖中的重要调控蛋白,研究HLA-G基因在妊娠中的功能在人类生殖学和免疫学具有重要的理论意义,有望成为人类辅助生殖中评价胚胎潜能的重要生化指标。 外源和内源性双链RNA(double-strandedRNA.dsRNA)在细胞内诱导同源序列基因表达受抑制的现象称为RNA干扰(RNAinterfering.RNAi)。RNAi现象在一系列的生物中存在,包括植物、真菌、锥虫、囊虫、果蝇和线虫。在培养的哺乳动物细胞中也观察到这一现象。越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)来抑制特定的哺乳动物细胞基因的表达。RNAi技术研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体术不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,而且在基因功能测定,基因治疗等方面开辟一条新思路。 目的:1.构建针对HLA-G基因的siRNA真核表达质粒载体,将其转染人绒癌JEG-3细胞株,观察其对人绒癌细胞JEG-3中HLA-G蛋白表达的沉默效应;2.建立HLA-G稳定降调节的JEG-3细胞株;3.针对HLA-G蛋白的降表达对NK-92MI细胞杀伤效应的检测。 方法:①依据siRNA设计原则,结合HLA-G基因的序列特征,借助生物信息学软件在线设计了两对靶向HLA-G基因的siRNA,并经本室检测有明显抑制效应。应用基因重组技术,构建HLA-G基因的siRNA真核表达质粒载体p S u p p r e s s o r - U 6 - n e o - H L A - G (简称p S u p - H L A - G )及阴性对照pSuppressor-U6-neo-ns(简称pSup-ns),并对其进行鉴定。应用脂质体分别将质粒pSup-HLA-G,pSuppressor-U6-neo空载体、pSuppressor-U6-neo-ns瞬时转染JEG-3细胞,应用RT-PCR、Western-blot等方法鉴定瞬时转染前后各组JEG-3细胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表达水平有无变化;②经过G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系,应用RT-PCR、Western-blot等方法检测、比对稳定转染siRNA真核表达载体前后JEG-3细胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表达水平的变化情况;③将NK-92MI细胞(效应细胞)与JEG-3细胞及降调节HLA-G的JEG-3细胞(靶细胞)共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比例时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。 结果:①成功地构建了HLA-G基因siRNA真核表达质粒载体pSup-HLA-G,RT-PCR及Western-blot等方法检测表明瞬时转染siRNA及pSup-HLA-G的JEG-3细胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表达均受到明显抑制;②建立了稳定降调节HLA-G基因表达的JEG-3细胞株;③NK-92MI细胞针对转染HLA-G的siRNA的滋养细胞的杀伤力增强了,说明HLA-G具有保护滋养细胞免受NK细胞杀伤的作用。 结论:本实验利用RNAi技术及基因重组技术,成功构建了pSup-HLA-G重组质粒;建立了稳定的HLA-G蛋白降表达的JEG-3细胞株,并证明了HLA-G具有保护滋养细胞免受NK细胞杀伤的作用。我们的研究为进一步研究HLA-G的生物学功能提供了平台,同时为进一步研究HLA-G的免疫学功能奠定了基础。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R714;R392
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