Notch和PTHrP双信号系统调控骨骺干细胞增殖与分化及其机制的初步研究

发布时间：2019-06-03 10:46

【摘要】： 第一部分Notch信号系统对骨骺干细胞生长的调控作用 实验1骨骺干细胞的体外培养及生长特性观察 目的:探讨体外培养鼠骨骺干细胞及其生长特性观察,为其应用奠定基础。 方法:采用显微取材后酶消化获取骨骺干细胞,用Percoll密度梯度离心法纯化,并测定其细胞生长曲线、细胞分裂指数、碱性磷酸酶活性,用免疫组化及免疫荧光染色的方法检测Ⅱ、Ⅹ型胶原的合成情况和透射电镜观察粗面内质网的丰富程度。 结果:鼠骨骺干细胞形状类似成纤维细胞,呈梭型,碱性磷酸酶活性低,粗面内质网少,Ⅱ型胶原合成量较多。 结论:体外培养的骨骺干细胞能向成熟阶段分化,可为软骨或骨组织工程提供理想的种子细胞。 实验2 Notch1信号系统对骨骺干细胞增殖与分化调控作用的初步观察 目的:研究激活的Notch1信号系统对体外培养的骨骺干细胞增殖与分化的调控作用。 方法:向体外培养的骨骺干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂γ-secretase inhibitorⅡ(MW167),空白对照加PBS缓冲液。用RT-PCR、免疫组化、MTT、流式细胞仪、碱性磷酸酶染色和Western Blot方法检测。 结果:骨骺干细胞中有Notch1和Jagged1表达;与对照组相比,rhNF-κB诱导组表达PCNA、CollagenⅡ蛋白明显增多,促细胞增殖作用明显(p=0.027),并且进入分裂期(S期)细胞增多(26.54%),而MW167诱导组碱性磷酸酶、CollagenⅩ蛋白表达明显增多,CollagenⅡ蛋白及分化标志蛋白stathmin表达明显减少。 结论:当Notch信号系统被激活时,骨骺干细胞进行增殖;当Notch信号系统被抑制时,骨骺干细胞进行分化。 实验3激活的Notch1信号系统抑制骨骺干细胞凋亡及其机制研究 目的:研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的骨骺干细胞凋亡及其机制。 方法:用RT-PCR检测骨骺干细胞中Notch信号系统的表达,并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-κB、抑制剂γ-secretase inhibitorII(MW167)和Bcl-2抑制剂HA 14-1,空白对照加PBS缓冲液,在凋亡诱导剂Celecoxib诱导后,用MTT检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡和Western Blot检测Hes-1及Bcl-2蛋白的表达。 结果:骨骺干细胞中存在Notch1/Jagged1信号通路,rhNF-κB组细胞活力增加,凋亡较少,Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显增加,而MW167组、HA 14-1组和对照组细胞凋亡明显,差异有显著意义(p0.05),且HA 14-1组和HA 14-1协同rhNF-κB组无Bcl-2表达。 结论:激活的Notch1信号系统通过促进靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制骨骺干细胞凋亡。 实验4 Notch信号系统对体外培养的鼠肢芽生长的调节作用 目的:研究Notch信号系统对体外培养器官生长的调节作用。 方法:体外培养孕16天鼠肢芽,通过测量其纵向生长长度、HE染色和甲苯胺蓝染色观察骨骺干细胞增殖与分化。 结果:与对照组相比,rhNF-κB实验组鼠肢芽纵向生长迟缓,MW167实验组纵向生长速度较快,差异有显著意义(p0.05)。rhNF-κB实验组表现出静止区骨骺干细胞明显增多,增殖区和肥大区成熟细胞所占比例较少;MW167实验组表现出骨骺干细胞明显处于分化状态,静止区骨骺干细胞非常少,增殖区和肥大区成熟软骨细胞所占比例明显增多。 结论:激活的Notch信号系统不仅对体外培养的骨骺干细胞增殖、分化有调节作用,而且对肢体内骨骺干细胞的增殖与分化也有调节作用。 第二部分Notch和PTHrP双信号系统的调控作用 实验5 Notch和PTHrP双信号系统调节鼠骨骺干细胞增殖与分化及其机制研究 目的:研究Notch和PTHrP双信号系统对骨骺干细胞生长的立体调节及其机制。 方法:通过免疫组化的方法检测Notch、PTHrP和AP-1共表达;转染PTHrP后MTT检测PTHrP协同Notch促进骨骺干细胞增殖,Western blot方法检测PTHrP协同Notch抑制其分化及PTHrP和AP-1的表达。 结果:当Notch信号系统被激活时,明显促进PTHrP和AP-1蛋白的表达;转染PTHrP基因后,促进骨骺干细胞增殖作用明显加强(p0.05),collagenX表达也明显减少,明显抑制骨骺干细胞分化;Notch被激活时,明显促进AP-1和PTHrP表达,Notch被抑制时,无AP-1和PTHrP表达。 结论:Notch通过介导AP-1来促进PTHrP的表达,Notch起横向调节作用,PTHrP起纵向调节作用,在骨骺干细胞生长分化过程中成立体调节。
[Abstract]:Regulation of the first part of Notch signaling system on the growth of bone-derived stem cells Experiment 1. body of bone-derived stem cells Objective of the observation of external culture and growth characteristics: to study the culture of rat bone in vitro The cell and its growth characteristics were observed and the basis was laid for its application. Methods: The bone-derived stem cells were obtained by microextraction, and purified by Percoll density gradient centrifugation, and the cell growth curve and cell division were determined. index, alkaline phosphatase activity, immunohistochemistry and immunofluorescent staining The synthesis of type 鈪，

本文编号：2491885