胚胎干细胞源性神经前体细胞的免疫原性及同源性树突状细胞对其在脑移植耐受中的作用

发布时间：2019-06-11 02:09

【摘要】： 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的全能性使之成为再生医学的最佳的种子细胞。在动物模型中已经成功进行了ESCs或其衍生物移植治疗脑缺血的试验研究,证明这种细胞能够替代缺失的神经元、修复神经环路、重建突触联系并促进神经功能恢复,因而ESCs已逐渐成为中枢神经系统细胞替代治疗(cell replacement therapy,CRT)最受瞩目的细胞。然而,这类细胞移植之后是被受者接受或整合还是被排斥,决定于受者体内的免疫反应机制,因而对这种机制的研究是十分必要的。以前人们认为脑是“免疫赦免”器官(immunologically privileged site),认为脑内移植细胞能无限期存活,但这种观点目前已被充分的事实证明打破。与此同时,有研究认为不同种类的ESCs通常仅表达少量的主要组织相容性复合物I(major histocompatibility complex -I,MHC-I)而几乎无MHC-II表达,因而也赋予ESCs相当的“免疫特权(immune privilege)”,但也有越来越多的事实证明这种免疫特权也是相对的,作为移植物的ESCs在一定环境中同样面临着免疫攻击的危险。因此针对ESCs免疫原性(immunogenicity)、移植免疫(transplantation immunity)以及移植免疫抑制(immunodepression)或耐受(immunotolerance)途径的研究应该受到重视。本试验初步探讨了ES-D3 ESCs及其诱导衍生物神经前体细胞(neural progenitor cell,NPC)的免疫原性及移植免疫现象,并试图通过同源的衍生细胞  胚胎干细胞源性树突状细胞(embryonic stem cell derived dendrtic cell,esDC)的联合移植来诱导对植入的NPC同种耐受。 第一部分体外诱导小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的分化 目的运用“五步”法诱导ES-D3系鼠胚胎干细胞(mESCs)向NPCs分化。 方法分化前ESCs在明胶瓶中传代培养去处滋养层,在培养基中加入1000u/ml重组白血病抑制因子(rLIF)阻止ESCs分化。单细胞悬液在去除rLIF的培养基中悬浮培养4d以形成拟配体(EB),转入无血清ITSF培养基培养6d富集nstin阳性细胞,在有丝分裂原碱性成纤维生长因子(bFGF)作用下扩增6d,撤销bFGF后在烟酰胺作用下诱导出神经样细胞。共计经过5个步骤。 结果经由无血清培养基可获得约80%以上的Nestin染色阳性NPCs,该细胞bFGF存在的情况下可反复传代与扩增。当去处bFGF后在烟酰胺的作用下,这些细胞可分化出GFAP或Tuj-1阳性的神经样细胞。 结论本实验从ESCs中诱导出nestin染色阳性的NPC,为进一步的神经生物学研究和细胞移植治疗提供了充足的细胞来源。 第二部分神经前体细胞的免疫原性及向脑缺血大鼠脑内移植免疫学现象观察 目的观察体外mESCs和NPCs的免疫原性及NPCs脑内移植之后的免疫学现象。 方法 1运用流式细胞仪检测ES-D3 mESCs细胞及其衍生NPCs细胞表面MHC-I、MHC-II的组成型表达,并在20ng/mlγ干扰素(IFN-γ)诱导作用下观察NPCs细胞表面MHC-I、MHC-II诱导型表达情况。 2建立MCAo模型并分组: I组,MCAo+NPC移植II组,MCAo+PBS(-)注射III组,MCAo(无处理) IV组,sham+NPC移植V组,sham+PBS(-)注射VI组,sham(无处理) 在术后(MCAo或者sham)两周行侧脑室NPCs移植。移植后两周取颈部淋巴结行淋巴细胞与NPCs共培养,MTT法观察淋巴细胞的增殖情况。免疫组化检测脑局部巨噬细胞标志物ED1及淋巴细胞标志物CD4、CD8分子的表达情况。 结果 1 ES-D3 ESCs在未分化前表面少量表达MHC-I但无MHC-II表达,经诱导分化成NPCs后MHC II分子表达无增高但MHC-I上升显著,运用IFN-γ诱导NPCs,其表面MHC-I进一步上调而MHC-II也轻度上调。 2颈淋巴细胞增殖指数(PI)检测显示相比sham组,MCAo组(I、II、III组)PI值增高(P0.05)其中以接受NPCs移植的I组最高,但MCAo组间差异未达统计学意义(P0.05)。sham组(IV、V、VI组)各组间PI亦无显著差别。 3脑内炎症细胞浸润:在sham组(IV、V、VI组)小鼠中和移植针道周围在少量CD4、CD8阳性细胞和ED1阳性细胞。而在MCAo组(I、II、III组)大鼠脑内的可见多量的炎性细胞浸润。其中,CD4阳性细胞在皮质(P0.01)和纹状体都显著升高(P0.01),在缺血皮质,组间CD4阳性细胞差别不显著,但在纹状体,接受NPCs移植的I组大鼠显示异常的CD4阳性细胞浸润(P0.01)。相比sham组,MCAo组大鼠CD8阳性细胞在皮质(P0.05)和纹状体都显著升高(P0.05),但MCAo各组间以及皮质和纹状体间差异不显著(P0.05)。ED1阳性细胞的反应模式与CD4一致,在纹状体内显示更高的表达且在I组大鼠中差异达统计学意义(P0.05)。意外的是,在接受NPCs移植的sham组中,纹状体区ED1阳性表达却有异常增高趋势(P0.01)。 结论:ESCs表达少量MHC-I类分子但不组成型表达MHC-II类分子;分化成NPCs后显著表达MHC-I类分子而MHC-II表达无变化,但在IFN-γ的作用下可上调MHC-I和MHC-II类分子,提示这些细胞本身可诱导针对MHC-I类分子的排斥反应,而在脑内的炎症环境中有可能进一步诱导针对MHC-II类分子的免疫反应。淋巴细胞增殖反应和脑内炎性细胞浸润模式提示脑缺血损伤本身是脑内免疫学激活的重要原因,而脑内炎性细胞亚型有差别的反应模式,如在NPCs移植大鼠纹状体内异常的CD4和ED1高表达提示可能存在针对移植细胞的排斥,包括CD4+Th1途径的活化及局部活跃的抗原引流。 第三部分ES-D3鼠胚胎干细胞向树突状细胞的诱导分化 目的直接从mESCs诱导分化出esDCs。 方法分化前ESCs在明胶瓶中传代培养去处滋养层,在培养基中加入1000u/ml rLIF阻止ESCs分化。单细胞悬液在去除rLIF的培养基中悬浮培养形成EB。取第14天的EB在含25 ng/ml重组鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和10ng /ml重组鼠白细胞介素-3(rmIL-3)的培养基中培养10天。运用流式细胞计数仪检测诱导细胞表面CD11c、MHC-I、MHC-II、CD86、CD80、CD83的表达情况。同时,运用脂多糖(LPS)刺激诱导细胞,观察其细胞形态学及MHC-II、CD80分子表达变化,并利用混合淋巴细胞培养观察其对同种淋巴细胞的刺激能力。 结果在rmGM-CSF和rmIL-3细胞因子的作用下,EBs在培养第4天开始出现大量早期的esDCs,在接下来的培养中细胞大量扩增。常规消化后这些细胞保持很高的增殖活性,更换新鲜培养基后细胞增殖活性无变化。流式细胞仪检测这些细胞表达高量的CD11c、低量的MHC-I,而不表达CD86、CD80、CD83及MHC-II,说明该细胞系不成熟的DCs(immature DC,imDC)。但当用LPS刺激作用后,该类细胞表现出成熟DCs(mature DC,mDC)的细胞形态并上调MHC-II、CD80分子,同时产生对同种淋巴细胞强烈的刺激作用(P0.05),但未经LPS刺激的细胞则没有明显的同种淋巴细胞刺激作用(P0.05)。 结论运用EB联合细胞因子rmGM-CSF和rmIL-3能从ESCs中直接诱导分化出esDCs,为大量获得耐受性imDCS开辟了新的途径。 第四部分胚胎干细胞源性树突状细胞在同源性神经前体细胞脑内移植耐受中的作用 目的用esDCs诱导针对同一来源NPCs脑内移植的免疫耐受。 方法 1运用pCX-eGFP转染的ESCs诱导分化表达GFP的NPCs 2动物MCAo模型并分组: I组:MCAo+NPCs移植组II组:MCAo+esDCs预处理+NPCs移植组 两组动物在手术后两周接受pCX-EGFP NPCs移植,II组则在接受移植前一周接受esDCs的皮下注射。移植两周后观察移植细胞的存活率、颈部淋巴结增殖率、脑局部免疫学分子ED1、CD4、CD8分子的表达、RT-PCR检测脑缺血半球TGF-β、IL-10的表达情况。 结果运用esDCS能明显抑制纹状体内CD4阳性细胞浸润,但对其他炎性细胞浸润、移植细胞存活、颈部淋巴细胞增殖以及脑局部细胞因子IFN-γ和IL-10的分泌则无影响。 结论esDCs预处理能减轻纹状体内的CD4阳性细胞浸润,有可能在以CD4+T细胞反应为主的免疫反应中诱导耐受,但缺乏相关的证据表明该过程是通过细胞因子依赖性调节性T细胞(Treg)来实现。且在该移植时间点上,esDCs预处理并没有对移植物存活产生明显影响,有关esDCs诱导耐受的作用尚待进一步研究。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392.1

【参考文献】

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3 徐海伟,吴旋,黎海蒂,范晓棠,曹娟,唐军;纤维连接蛋白在小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞中的作用(英文)[J];中国临床康复;2003年23期

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本文编号：2496923