SAPAP3基因敲除小鼠中的皮层—纹状体突触功能缺陷和类OCD行为

发布时间：2019-06-17 16:11

【摘要】： 了解突触行使生理功能的分子机制对于阐明神经系统中神经元如何进行相互的信息交流具有重要意义。目前对于突触后分子的装配以及功能的了解仍不深入。人们已知突触后组织大约由数百个蛋白质组成,但对这些蛋白的生理功能仍所知甚少。目前仅初步了解了其中的极少数蛋白的生理功能。目前比较流行的突触发育的模式是一群主要的支架蛋白通过提供多个锚定位点和与肌动蛋白细胞骨架连接位点,将大分子复合物装配在突触后膜。本论文的目的是研究作为关键的突触后蛋白之一,SAPAP(SAP90/PSD95 associated protein)蛋白家族在体内的生理功能,以此作为进一步深入研究突触后蛋白分子装配及功能的基础。我们综合应用了遗传学,生物化学,电生理学以及行为学的研究方法来阐明SAPAP3蛋白在突触发育和功能中的作用,并研究了SAPAP3蛋白与类强迫性神经症(Obsessive-compulsive disorder,OCD)行为的关系。为了研究SAPAP蛋白家族的体内生理功能,我们首先制备了SAPAP3基因敲除小鼠(SAPAP3 knock out小鼠,以下均称为SAPAP3突变小鼠)。并用尾巴PCR和Southern印迹和Western印迹法进行了验证。SAPAP3突变小鼠总体上是正常的并能正常生育,但是在达到4—8月的年龄的时候,这些基因敲除小鼠100%表现出脸部和颈部等部位损伤的情况。这些损伤是这些基因敲除小鼠的自我损伤,这提示这些小鼠可能具有某些行为上的病理性缺陷。通过对24小时录像解码的分析发现,SAPAP3突变小鼠与野生型小鼠相比,梳理行为的次数和时间显著增加。重要的是,SAPAP3突变小鼠在发生脸、颈等部位损伤前和发生损伤后具有相同程度的梳理行为。这些数据证明SAPAP3突变小鼠有病理意义的梳理行为。为了研究是否这些SAPAP3突变小鼠有增高的焦虑水平,我们做了开放场试验(open field test),O型迷宫试验(elevated zero maze test),和暗/亮箱试验(dark to light emergence test)。在所有这三个试验中,SAPAP3突变小鼠都表现出增高的焦虑水平。 SAPAP3突变小鼠的这种过度梳理行为和增高的焦虑水平让人联想起人类OCD类疾病的症状。由于选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(Selective SerotoninReuptake Inhibitor(SSRI))被广泛应用于治疗OCD病人并且在50%的病人中有不同程度的疗效。我们也用fluoxetine(一种SSRI)对SAPAP3突变小鼠进行了连续6天的治疗,我们发现fluoxetine处理可以有效地缓解SAPAP3突变小鼠的过度梳理行为和焦虑水平。 OCD是焦虑类型的神经症,特点是患者具有持续性的强迫性观念和强迫性的重复行为。以前的研究已经表明OCD的发病与皮层.纹状体—丘脑—皮层环路的功能缺陷有关。但是OCD的具体发病机制仍是个谜。考虑到SAPAP3是SAPAP蛋白家族中唯一在纹状体中高表达的成员,SAPAP3突变小鼠是唯一的具有类OCD行为表型的基因敲除小鼠,这强烈提示在SAPAP3突变小鼠中可能有纹状体突触功能的缺陷。所以我们做了纹状体脑片的场电位记录。我们发现在SAPAP3突变小鼠中总的场电位降低,但NMDA(N-methyl-D-aspartate)受体介导的场电位却增高,这说明SAPAP3可以调节AMPA(a-amino-3-hydroxv-5-methvl-4-isoxazolepropionate)和NMDA这两种类型的谷氨酸受体的突触活性,但调节的方向相反。我们随后通过生物化学的方法研究了SAPAP3突变小鼠的纹状体的突触后装配。结果显示SAPAP3突变小鼠的纹状体的PSD(Post SynapticDensity)中NR1的水平明显增高,有趣的是,我们也发现NR2B(非成熟型亚单位)的水平也显著增高,而NR2A(成熟型亚单位)的水平下降。这提示在SAPAP3突变小鼠中NMDA亚单位的转换没有发生,或者转换后NMDA亚单位的构成没能得到维持。结合电生理学试验,这些结果提示SAPAP3在皮层-纹状体突触的功能的成熟上起重要作用。另外,通过电子显微镜观察,我们发现SAPAP3突变小鼠的纹状体的“致密层”与野生型小鼠的“致密层”相比厚度减少。由于在SAPAP3突变小鼠中发现了皮层-纹状体突触功能的缺陷和结构的改变,结合以前关于纹状体环路在OCD发病中的作用的理论,我们进一步研究了在纹状体中选择性表达SAPAP3是否可以纠正该小鼠的表型,以验证是否SAPAP3的缺失是引起SAPAP3突变小鼠表型的原因。我们将表达GFP(Greenfluorescence protein)-SAPAP3融合蛋白的lentivirus注射入SAPAP3突变小鼠的双侧纹状体中。在注射后4-6月,我们分析了这些小鼠的梳理行为、脸部损伤和焦虑行为。通过连续的录像记录分析,我们发现GFP-SAPAP3在纹状体的重新表达可以缓解SAPAP3突变小鼠的强迫性梳理行为和缓解脸部损伤,并可以减缓焦虑行为。所以,纹状体中表达SAPAP3可以纠正SAPAP3突变小鼠的行为表型。然后我们研究了纹状体切片中的皮层-纹状体的场兴奋性突触后电位(fieldExcitatory Post Synaptic Potentials,fEPSP)。结果发现,与对照组(即仅注射GFPlentivirus载体的SAPAP3突变小鼠)相比,纹状体中GFP-SAPAP3的表达可以纠正纹状体的fEPSP。这些结果支持了关于SAPAP3在皮层-纹状体突触中起作用作用的观点,同时也提示了皮层-纹状体环路在OCD发病中的作用,证明了SAPAP3在SAPAP3突变小鼠的类OCD行为的发病过程中的决定性作用。由于我们的数据强烈提示SAPAP3介导的皮层-纹状体-丘脑-皮层环路在OCD的发病中扮演重要的角色,我们将用BAC转基因小鼠的方法直接验证这个想法,在这些转基因小鼠中,SAPAP3的表达是可以被Cre重组酶调节的。如果将时空可控表达Cre的转基因小鼠系与Cre重组酶调控性SAPAP3表达的转基因小鼠交配,在所得的后代中,就可实现SAPAP3时空可调控的表达。通过将两侧有Loxp位点的STOP盒放置于SAPAP3 cDNA之前,并加上HA标记(也因而命名为HA-SAPAP3~(STOP)),我们首先成功地制备了这些BAC转基因小鼠,通过将这些小鼠与全基因组表达Cre的转基因小鼠交配后,我们用抗-HA染色和western blotting的方法发现HA-SAPAP3~(STOP)在小鼠表达情况与野生型小鼠的内源的SAPAP3表达特征基本一致。所以这些HA-SAPAP3~(STOP)将为进一步的研究提供很好的实验工具。综上所述,我们的研究证明了SAPAP3在皮层-纹状体突触中的扮演的决定性角色,并阐明了皮层-纹状体环路在OCD类行为中的重要作用。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R33

【共引文献】