雪旺细胞表达TNF-α在炎症过程中的作用及相关机制

发布时间：2019-07-26 08:03

【摘要】： 【研究背景及目的】雪旺细胞(Schwann cell, SC)是周围神经系统特有的胶质细胞。它除了在髓鞘形成、营养支持及轴突再生等方面发挥重要的作用外,它还与中枢神经系统非髓鞘形成的胶质细胞一样,发挥潜在的一些免疫功能。雪旺细胞能够被诱导产生细胞因子和化学趋化因子,表达MHC-Ⅱ(Major histocompability complex)类分子及黏附分子,并发挥抗原提呈细胞的功能。肿瘤坏死因子-alpha(Tumor necrosis factor factor-alpha, TNF-α)是一个多功能的细胞因子,以可溶型和跨膜型两种形式存在,主要介导免疫及炎症反应。在体内,坐骨神经受损后,损伤部位的雪旺细胞被激活并产生TNF-α。然而,TNF-α合成的确切机制仍然不太清楚。它主要通过不同的细胞表面受体TNFR(Tumor necrosis factor factor Receptor)Ⅰ(p55)、TNFRⅡ(p75)来发挥它的生物学功能。为证明SC作为一种重要的免疫活性细胞参与周围神经系统损伤或感染后的免疫炎症反应,本课题首先从参与炎症反应的重要细胞因子——TNF-α入手,深入分析SC合成TNF-α的分子机制,然后研究以自分泌方式产生的TNF-α作用于雪旺细胞后所发挥的生物学功能。此研究结果为雪旺细胞作为免疫活性细胞提供了初步的理论基础,并且可能为临床上雪旺细胞参与神经退行性疾病的发病机制提供理论依据。【方法】 (1)不同浓度,不同时间用LPS刺激雪旺细胞,用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)分别检测细胞胞液和上清中分泌的TNF-α的表达量;RT-PCR(Reverse transcript-Polymerase Chain Reaction)检测细胞中TNF-αmRNA的表达;同时用免疫荧光细胞化学染色检测TNF-α的细胞定位;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( terminal deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate nick end-labeling, TUNEL)检测LPS对细胞活力的影响。 (2)采用Western blot检测细胞中MAPK(ERK、P38和SAPK/JNK)、NF-κB P65、IκB-α、P-IκB-α及IκB-β的活性;分别用MAPK的特异性抑制剂(PD98059、SB202190和SP600125)预处理细胞后用ELISA检测细胞中TNF-α水平;RT-PCR检测细胞中TNF-αmRNA、LITAF mRNA、CD14 mRNA、TLR4 mRNA及MyD88 mRNA的表达;用间接免疫荧光单标法检测MAPK及NF-κB P65的表达定位。 (3)采用RT-PCR和流式细胞术检测TNFRⅠ、TNFRⅡ在雪旺细胞上的表达;为了证实TNF-α作为一个自分泌介质激活雪旺细胞,分别采用RT-PCR或ELISA检测细胞因子在雪旺细胞上的表达;采用细胞活力检测试剂盒(CCK-8)以及TUNEL反应检测TNF-α对细胞活力的影响. 【结果】 (1)用10μg/ml LPS刺激后2h能显著促进雪旺细胞浆内TNF-α的表达,同时也检测到培养液上清中有TNF-α的释放。间接免疫荧光显示LPS刺激后TNF-α表达于雪旺细胞浆。100μg/ml LPS刺激细胞24h后可以导致细胞明显的凋亡。 (2)LPS可显著激活雪旺细胞中的ERK, P38和SAPK/JNK信号通路。ERK激活高峰在LPS刺激后30～45 min,60 min后ERK磷酸化水平开始逐渐下降;P38和SAPK/JNK的磷酸化发生在刺激后30 min,45 min开始逐渐下降,120 min时又达到最高水平。分别用其抑制剂PD98059、SB202190及SP600125预处理细胞后,可显著抑制细胞TNF-α以及TNF-αmRNA的产生;LPS刺激细胞后引起ERK, P38和SAPK/JNK磷酸化,PD98059、SB202190及SP600125可抑制该过程。间接免疫荧光显示:经LPS刺激的雪旺细胞浆有磷酸化ERK、P38和SAPK/JNK的表达,使用MAPK抑制剂预处理细胞后,胞浆中的荧光强度减弱。在静息状态下,NFκB P65仅位于雪旺细胞浆。经10μg/ml LPS刺激细胞20 min后,IκB-α和IκB-β通过IκB激酶(IKK)发生磷酸化后在细胞浆中降解。NFκB P65经LPS刺激细胞10 min后移到核周区,经40 min后,P65完全转位到细胞核。雪旺细胞经LPS刺激后高表达TLR4 mRNA和MyD88 mRNA,而CD14 mRNA在刺激前后都表达。 (3)RT-PCR和流式细胞术显示TNFRⅠ在雪旺细胞上高表达,TNFRⅡ表达较低。以自分泌介质存在的TNF-α与雪旺细胞表面的TNFR结合可以诱导TNF-α的产生,它也可以诱导其他炎症介质(iNOS、IL-6、IL-10)的产生。细胞活力检测和TUNEL分析显示TNF-α可以诱导雪旺细胞的凋亡。【结论】 (1)细菌的致病因子——LPS的诱导确能促进雪旺细胞高效表达和分泌炎性细胞因子TNF-α,从而为雪旺细胞作为免疫活性细胞在周围神经系统中发挥免疫调节作用提供初步依据。 (2)LPS与雪旺细胞表面CD14及TLR4结合从而激活MAPK信号通路,继而激活NFκB P65并发生核转位,启动TNF-α的转录。MAPK信号通路的激活及NFκB P65的核转位可能是LPS诱导TNF-α表达的前提。通过阻断细胞内信号转导通路来减少TNF-α及其它细胞因子的产生,为抑制周围神经损伤后的炎症以及免疫反应发生提供了一条新的思路。 (3)在周围神经系统,从激活的雪旺细胞来源的TNF-α作为一种炎症介质发挥着很重要的功能。一方面,它与靶细胞表面TNF-α受体结合可以诱导TNF-α或其他炎症介质的产生;另一方面,它可以诱导雪旺细胞凋亡。这种神经保护性或神经毒性效应主要是通过与不同的细胞表面受体结合来介导的。
【图文】：

图 3：LPS 刺激大鼠雪旺细胞后 TNF-α mRNA 的时间依赖性表达Fig3 Time-course of TNF-α mRNA expression inLPS (10 μg/ml)-stimulatedrat Schwann cell.2.2 LPS 诱导雪旺细胞合成 TNF-α表达的时相变化LPS 能明显地诱导雪旺细胞分泌 TNF-α。ELISA 结果显示：随刺激时间延长，TNF-α 水平逐渐升高，与 0 时相组比，10 μg/mlLPS 刺激后从 1 h 开始即有 TNF-α 合成上升（P<0.05），2h 达到峰值（P<0.01），然后随着时间的延长 TNF-α 的合成逐渐下降。由表 1 统计结果可以看出，刺激组与未刺激组之间的差异均有统计学意义（P<0.01），而刺激 2 h与 3 h 之间 P=0.077（P>0.05），二者间无统计学差异，，即刺激后 TNF-α的合成高峰在 2-3 h 之间（图 4）。表 1 不同时间 LPS 刺激对雪旺细胞 TNFα合成的影响Table 1. Effect of different times of LPS on TNF-α synthesistime（h） LPS （μg/ml） TNFα （pg/ml）

雪旺细胞表达TNF-α在炎症过程中的作用及相关机制

图 4 TNFα 的合成量与 LPS 刺激时间之间的关系Fig 4.The relationship between the synthesis of TNFαand the stimulated times of LPSLPS 诱导雪旺细胞合成 TNF-α时 LPS 的最适浓度LISA 结果显示：随刺激浓度变化，TNF-α 合成水平也有明ml LPS 刺激 2 h 后 TNF-α 合成量达到最大（P<0.01）。由可以看出，刺激 1 μg/ml 与未刺激组之间 P<0.05，而刺激 1激组之间 P<0.001，有明显的统计学差异（图 5）。表2 不同浓度的LPS对TNF-α合成量的影响Table 2. Effect of different concentrations of LPS on TNFα synthesisLPS （μg/ml） time（h） TNFα （pg/ml）0 2 70.79±12.56#1 2 87.72±1.03*10 2 195.08±1.77**100 2 109.56±7.96***
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392.11

【参考文献】