逆向点杂交方法检测结核分支杆菌耐药基因katG、rpoB突变

发布时间：2019-07-28 15:26

【摘要】：近年来受到人口流动性加大、人口老龄化、过分依赖卡介苗、人免疫缺陷病毒(HIV)与结核分支杆菌共感染、毒品及女性吸烟等诸多因素的影响,结核病死灰复燃,全球呈大回升之势。结核分支杆菌耐药性的产生和传播更加剧了结核病的流行。作为标准化疗的一线药物,利福平和异烟肼在结核病的治疗中发挥了重要的作用。然而,由于对这两种药物耐药株的产生使其联合治疗的有效率降低到77%。快速、准确的检测菌株的耐药情况不仅有助于选择最适的治疗方案继而提高治疗效果,而且有助于阻止耐药菌株的传播,因而具有非常重要的意义。研究表明,异烟肼耐药株的产生是由katG、inhA、kasA、ahpC、ndh等多基因控制的。其中,60%-70%的耐药株是由于katG基因第315位密码子突变所致,且这一突变与高耐药量密切相关。因此,katG基因是异烟肼耐药性检测的首选基因。利福平的耐药机制主要是由于编码RNA多聚酶β-亚基的rpoB基因发生突变,导致利福平无法与RNA聚合酶结合,引起结核分支杆菌耐药。约有90%～95%的利福平耐药株存在rpoB基因的突变,且均集中在编码511-533位共23个氨基酸的69bp核心突变区,因此,通过对该区域基因序列的分析可以检测对利福平的耐药性。而在各个国家和地区,这些位点突变的几率均有差异,在我国,最近一篇文献报道,在利福平耐药的结核分支杆菌中,526位突变占40%,531位突变占41%,516位突变仅占4%。我国结核分支杆菌耐多药情况同样令人担忧:初始耐药率为28.1%,继发耐药率为41.1%,并且均以耐异烟肼、利福平一线药物为主,耐多药(MDR)现象严重,所以耐药性问题己构成了对结核病控制规划的严重威胁。因此对抗结核药物耐药性进行系统研究和检测,建立先进的耐药性测定方法,以指导结核病的防治具有十分重要的现实意义。开展这方面的研究,准确,全面的检测katG、rpoB基因突变十分必要。目前已有文献报道多种分子生物学检测方法用于检测这两个基因的突变,如SSCP法,RFLP法,实时PCR法,线性探针杂交法:这些方法都有自身的优缺点,且大部分不能同时对katG、rpoB基因突变进行捡测。目前,国际上已有商业化的INNO-LiPA Rif TB检测试剂盒(比利时Innogenetics NN公司)可以检测出rpoB基因第531位、第526位四种耐药突变,具有简便、快捷,特异性、敏感性较强的特点,临床指导用药效果良
【图文】：

图139#样本的DNA测序结果注:用Pl引物进行单链测序，315位突变处用下划线表示，为gac一aac突变，氨基酸由Ser突变为Thr。S匆naIG:599A:599TBD3T叹B)口卜1.n优白H付以幻7尸d川51125ot27印:179C:516Pk11工(:1071内弟，Of，入拍3If12’旧，，’14:07以幻3ff12’唱矿:955S伸cl叩:，.03次，.033)

逆向点杂交方法检测结核分支杆菌耐药基因katG、rpoB突变

R质粒PRC产物在65℃的条件下与膜条在杂交炉中杂交:克隆katG基因3巧位发生AGC~ACC突变的质粒条在显色液中显色的时间为Zmni杂交的最适温度，以降低非特异性杂交。用R应该是能与PRC产物杂交的R探针显色，而其都不能与CPR扩增产物杂交，因而都不能显色。GCATS探针的序列为ACGCGACCAGCAGCG(汇AT，用R碱基用黑体标出。设计51、Rl探针的目的主要片中非特异性明显，须进一步提高杂交的温度。5R51RIS探针为
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R346

【参考文献】