尘螨变应原特异的重组人单抗IgG Fab片段的制备及生物学活性研究

发布时间：2019-09-12 12:29

【摘要】：变态反应性疾病特别是哮喘是危害严重的全球性公共卫生问题,在大多数国家,哮喘的发病率及死亡率呈持续上升趋势。尘螨变应原是引起变态反应性疾病的重要病因之一,特别是引起儿童变应性哮喘的重要危险因子。变应性疾病的病因复杂,除了复合多基因式遗传外,出生前后与环境变应原的接触也至关重要。鉴于此,WHO提出儿童变应性疾病的三级预防理论并呼吁一级预防应成为今后研究的重点。多项研究表明孕期母体高水平的变应原特异IgG抗体对胎儿今后发生变应性疾病具有抑制作用。因此,本课题拟制备尘螨变应原特异的人源抗体IgG Fab片段用于螨性变应性疾病的防治研究。首先分离接受尘螨注射液脱敏治疗并证实具有高水平抗尘螨IgG的变应性哮喘患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,构建非依赖性克隆滴度为8×108的抗尘螨变应原的IgG抗体库；同时分离近两个月内未曾患感冒等感染性疾病的300名健康志愿者的外周血淋巴细胞,同法构建非依赖性克隆滴度为9×108的人IgG抗体库。以实验室培养的粉尘螨制备粉尘螨螨体浸出液、代谢培养基浸出液并利用基因工程手段制备重组2类变应原rDer f 2。分别以上述天然粗抗原及重组变应原作为抗原,采用克隆印迹法和ELISA法对抗体库进行多轮筛选,共筛选克隆数约为1.8×106个,经反复验证,最终获得两个可与尘螨变应原特异性结合的阳性克隆,命名为AM1和AM2,序列比较的结果显示两个克隆的重链是完全同源的。阳性克隆AM1的轻链与抗尘螨变应原的重链库重组,构成重链更替的抗体库,以重组的Der f 2作为抗原,经克隆印迹法筛选,获得1个亲和力提高的特异性阳性克隆AM1L-Hsh。AM1的轻链可变区近似系为K2-30,基因同源性为87%；重链可变区近似系为VH3-30,基因同源性为96%；AM2的轻链可变区近似系为K3-27,基因同源性为95%；AM1L-Hsh的重链可变区近似系为VH5-1。对上述3个Fab片段进行大量表达,并以金属螯合亲和层析法进行纯化,表面等离子共振BIAcore检测显示均有较高的亲和力,解离常数在1.27×10-9-6.3×10-8之间,链替换改造后亲和力有8倍提高。ELSIA、斑点印迹等检测证实纯化的抗体可特异性识别重组2类变应原及天然粗抗原。肥大细胞脱颗粒抑制试验显示尘螨变应原特异的IgG Fab片段可显著抑制肥大细胞的脱颗粒反应,提示Fab片段具有竞争性抑制抗原结合的作用。尘螨变应原特异的重组人单抗IgG Fab片段的制备和研究工作,为进一步应用变应原特异的IgG抗体预防和治疗螨性变应性哮喘提供了理论和实验依据,至今尚未见国内外相关研究报道。
【图文】：

酶切,扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,引物

2.1PCR反应扩增 DerfZ基因采用引物 DerfZ一S一 Nde/DerfZ一AS一Xho，从粉尘蜗cDNA中经30个循环的PCR扩增反应，获得的PCR产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1一3，片段大小为4O6bp。bp1000-500-斗 DerfZ M.100bPLadderDNAMarker1.PCR扩增产物图1一3.粉尘瞒2类变应原的PCR扩增2.2重组质粒pET19b一 DerfZ的构建及酶切鉴定以从企I和肠01对重组质粒pET1gb一 DerfZ进行酶切，得到大小为5717bp的表达载体pET19b和大小为406bp的目的基因片段两个产物(图1一4)，证实目的基因插入位点及插入片段大小均正确。重组质粒DNA含量估计为25ng/州。bP载体 5717bP1000-500-插入片段406bPMloobpLadderDNAMarker重组质粒的刀山I和JA火01酶切产物图1一4.重组质粒pET19b一 DerfZ的酶切鉴定第25页共101页

酶切,扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,引物

2.1PCR反应扩增 DerfZ基因采用引物 DerfZ一S一 Nde/DerfZ一AS一Xho，从粉尘蜗cDNA中经30个循环的PCR扩增反应，获得的PCR产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1一3，，片段大小为4O6bp。bp1000-500-斗 DerfZ M.100bPLadderDNAMarker1.PCR扩增产物图1一3.粉尘瞒2类变应原的PCR扩增2.2重组质粒pET19b一 DerfZ的构建及酶切鉴定以从企I和肠01对重组质粒pET1gb一 DerfZ进行酶切，得到大小为5717bp的表达载体pET19b和大小为406bp的目的基因片段两个产物(图1一4)，证实目的基因插入位点及插入片段大小均正确。重组质粒DNA含量估计为25ng/州。bP载体 5717bP1000-500-插入片段406bPMloobpLadderDNAMarker重组质粒的刀山I和JA火01酶切产物图1一4.重组质粒pET19b一 DerfZ的酶切鉴定第25页共101页
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392.8

【参考文献】