重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

发布时间：2019-09-18 14:04

【摘要】：本文采用大肠杆菌(E.coli-BL-21-DE3)为宿主细胞,pGEX4T-2质粒为载体来表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2),分别研究了目的蛋白的表达、复性、纯化及活性鉴定。本研究包括以下三个部分的工作: (1)表达 研究了单独表达目的蛋白和融合有GST的情况下,在19℃、IPTG浓度为0.05和0.1mM的时,目的蛋白的表达情况;发现几乎不存在目的蛋白的可溶性表达,目的蛋白大都以包含体形式存在。接着,我们优化了IPTG的诱导浓度以提高目的蛋白表达量,结果示:当IPTG的浓度约为0.2～0.4时,目的蛋白表达量最大。 (2)稀释和透析复性 分别采用分步稀释和分步透析两种方法,以尿素作为助溶剂,对目的蛋白进行复性,结果表明:稀释复性法目的蛋白的收率不足5%,透析复性法收率不足1%。 (3)羟基磷灰石色谱复性基于天然BMP-2能够与羟基磷灰石(HA)结合和色谱复性的理论基础,我们提出了利用HA色谱复性法来复性rhBMP-2的策略;通过优选填料,摸索上样、洗脱及氧化等条件,较为系统地研究了该复性方法的基本操作条件。实验发现变性剂能够降低HA吸附蛋白质的载量,而不加用变性剂或用量很少又会导致变性蛋白在柱子中的沉淀;HA可以吸附常用氧化剂还原型和氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG),降低其氧化效果。据此,本文提出了色谱复性时,在进样前后加用少量变性剂的策略,并优化了上样时变性剂的用量及变性蛋白的浓度,有效地改善了目的蛋白的吸附情况、提高了目的蛋白复性率;本文提出了柱后氧化的策略,并设计实验,以溶菌酶为研究对象观察了柱后氧化与柱中氧化的差异,证明了柱后氧化的优越性。接着,研究了目的蛋白柱后氧化的条件,初步分析了pH值、温度、蛋白浓度和GSSG、GSH的比例对目的蛋
【图文】：

四川大学硕士学位论文亲和填料作用的成分，，该条带为融合蛋白的可能性不大。本图采R一250染色。G对非融合目的蛋白表达量的影响电泳图上看(图7)，几组细菌中目的蛋白表达的差异不十分明显。系统软件(Quant1ytOn)e分析后发现:以0.2~0.4Mm时目的蛋最高，约占细菌总蛋白的17.%6。

图337’C时目的蛋白表达电泳图为分子量，arker，2为未诱导的工程茵，诱导后3.5小时的工程菌，4为粗制包含体图4包含体蛋白的We:ter--nbl23和融，昌缉
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R346

【引证文献】

相关硕士学位论文 前2条

1 王婧;重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽原核表达及单克隆抗体制备[D];北京协和医学院;2011年

2 滕婷婷;人IgE受体蛋白FcεRIα-D2的原核表达及其对IgE的选择吸附能力研究[D];大连理工大学;2012年

本文编号：2537545