HSP65-PSA多表位融合蛋白疫苗的功能研究

发布时间：2019-10-14 02:47

【摘要】：分子量为65KD的卡介苗热休克蛋白(BCG HSP65)具有分子伴侣功能。在免疫应答过程中,HSP65与肿瘤表位抗原形成的融合蛋白,通过受体介导进入树突状细胞(dendritic cell, DC),HSP65协助与之融合的抗原,进入MHC I类加工途径并递呈在细胞表面,从而激活抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的免疫反应。本研究针对前列腺癌肿瘤相关抗原(PSA)的表位抗原,设计并制备了HSP65融合蛋白疫苗,拟将其研制成一种能诱导产生PSA特异性CTL的前列腺癌的预防性或治疗性疫苗。我们将编码分支杆菌热休克蛋白65基因与多个PSA表位基因进行融合,在大肠杆菌中表达多表位融合蛋白(HSP65-PSA)。首先我们构建了表达人PSA多表位基因的、来源于C57BL/6小鼠的B16、RM1和EL4三种肿瘤细胞系。应用此三株细胞在小鼠体内进行抑瘤的实验表明:HSP65-PSA能够诱生小鼠的PSA特异性CTL,对表达人PSA的小鼠肿瘤细胞的生长产生不同程度的抑制作用。体外功能实验表明:用HSP65-PSA装载人DC的HSP65-PSA诱导产生的CTL,能够杀伤装载HLA-A2限制性PSA表位肽的T2靶细胞。PSA表位肽装载树突状细胞(dendritic cell, DC)用于刺激自体naive T淋巴细胞产生的CTL,能够杀伤表达全长PSA蛋白的人前列腺癌细胞系LNCaP。为了研究HSP65-PSA的作用机理,我们制备了HSP65单克隆抗体和FITC标记的HSP65,并研究了人DC可能存在的HSP65受体。结果表明:人DC表面存在HSP65受体,此受体与CD91分子无相关性。以上工作表明,HSP65-PSA重组蛋白可能通过DC的HSP65受体发挥其抗肿瘤作用,它有希望成为有效的前列腺癌预防性和治疗性疫苗。
【图文】：

脂质体法,转染效率,脂质体转染,转染

吉林大学博士学位.2 机械介导方法提高脂质体转染效率建立一个快速有效的脂质体转染方法，我们对传统的脂质体转染方法过脂质体和机械介导的脂质体改良转染方法，将 pCDNA3-GFP-PSA 质粒、EL4 和 RM1 细胞，经 G418 选择培养 2 周后，以转染 pCDNA3 的同种小检测的阴性对照，，流式细胞术检测结果（图 2）显示：机械外力介导达 GFP 的阳性率（26％，24％，40％）明显高于单纯脂质体转染的细6％，18％），说明在脂质体转染过程中，增加玻璃滴管介导的转染方质体的转染效率。我们对改良法获得的转染细胞进行克隆筛选，并与染方法在转染流程和克隆筛选周期方面进行比较。

转染细胞,流程,转染,传统法

吉林大学博士学位.3 改良法与传统法在转染和克隆筛选方面的比较对比改良法与传统法在转染和克隆筛选方面的差别，用图示方法（方法从转染前细胞准备到获得转染细胞株的流程。比较结果显示：制备细胞，转染时不受细胞密度和生长状态影响，细胞数可精确定体生化转染过程中，增加简单的滴管介导的物理转染过程，不需要择性扩增培养和胰酶的消化，直接进入克隆化和选择培养阶段。在上，改良法获得的单克隆转染细胞株的时间，至少比传统法提前 2 由于结合了脂质体的化学转染和滴管介导的物理转染过程，可获得率，经过克隆筛选后，有更多机会获得稳定表达外源基因的转染细染 2 周时，通过共聚焦显微镜观察，获得表达外源报告蛋白 GFP 的株可进入 6 孔培养板扩增。转染 4 周时，细胞可进行冻存和进一步可知：改良法比传统法具有许多优势。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

【共引文献】