人源性肺表面活性物质制备和研究

发布时间：2019-10-21 18:54

【摘要】： 肺表面活性物质(Pulmonary Surfactant，PS)是一种主要由磷脂和特异性蛋白质组成的脂蛋白复合物。PS的缺乏可引起呼吸窘迫综合症，特别在早产儿，发病率和死亡率都很高。自1980年PS首次被临床应用后，许多国家竞相研制PS新药。迄今已研制出10多种药物。根据来源不同，将PS药物分为4类：1．天然型PS(Natural Pulmonary Surfactant)从动物肺或人羊水中提取。主要从猪肺和小牛肺灌洗液或肺匀浆中制备。2．改进的天然型PS(Modified Natural PulmonarySurfactant)：在天然型PS中补充适当比例的某些PS主要成分，如二棕榈酰卵磷脂(Dipalmitoyllecithin，DPPC)和磷脂酰甘油(Phosphatidyl glycerol，PG)。使天然型药物更加有效。3．人工型PS(Artificial or Synthetic Pulmonary Surfactant)：由几种人工合成的PS主要磷脂成分或其它代用品按一定比例配制而成其主要特点是不含PS蛋白质。4．合成的“天然”型PS(Synthetic″Natural″Pulmonary Surfactant)：由人工合成的PS主要磷脂成分加一定比例的用基因工程生产的PS蛋自质配制而成。我国市场上仅有两种肺表面活性物质制剂被批准上市销售，一是意大利凯西制药公司生产的固尔苏(Curosurf)，剂型为混悬剂，价格昂贵，每支售价为4500元。另外一种是首都儿科研究所与双鹤药业公司合作开发的注射用牛肺表面活性剂，剂型为冻干粉，于2005年11月取得国家药检局的新药证书，每支售价为3750元。本文研究的人源性肺表面活性物质(Hominine PulmonarySurfactant，HPS)从矽肺病人双肺大容量灌洗液中提取，是一种全新的PS产品。目前国内外尚未见相关报道。 我们在北戴河煤矿工人疗养院，对废弃的肺灌洗液鉴定了PS和人肺表面活性物质相关蛋白A(Hominine Pulmonary Surfatcant-associated Protein A，SP-A)水平。确定有利用价值后，优选了提取和纯化的条件，并利用这些条件提纯了PS和SP-A，进行了体外活性实验和化学成份分析。对比前人，我们的PS和SP-A来自于人体肺灌洗液，有人源性的优势。同时在技术上利用透析方法简化实验劳动，利用层析纯化的方式纯化PS和SP-A，都是目前为止没有报道过的创新之处，希望对未来患病的新生儿带来福祉。最后对矽肺病人肺内PS水平进行了测定，对大容量灌洗后肺内PS水平不同时间段恢复情况进行了测定，希望可以造福于值得我们尊敬和热爱的煤矿工人们。 第一部分矽肺病人双肺大容量灌洗液的鉴定 目的 了解矽肺病人大容量肺灌洗液中提取PS是否可行。 方法 矽肺病人大容量全肺灌洗：手术室诱导麻醉，支气管双腔导管插管；纯氧通气，分隔两肺，支气管套囊注气3ml；单肺通气，送检血气分析，监测血压、心电图、PaO2；左肺灌洗，0.9％氯化钠灌洗液500ml／次，连续8-16次。采用Carlens管；观察情况，一般情况好的(血压、心电图、PaO_2稳定)行右肺灌沈。方法同前。不稳定的择期再灌洗右肺。(2-3天后) 鉴定肺灌洗液：显微镜检12例灌洗液细胞成分比例，Ⅰ期和Ⅱ期病人各6例。灌洗液在4℃、1500×g离心15min，上清液在4℃、13000×g离心60min，收集所得的乳白色沉淀，即为HPS粗品，共收集12人次，Ⅰ期和Ⅱ期病人各6例。 ELISA方法鉴定PS含量：两组矽肺病人分Ⅰ、Ⅱ期各6人次。孔雀绿直接显色法检测无机磷含量，间接推测磷脂含量。SP-A单抗B6B4E9H4D做40ug／ml稀释，包被板条，4℃过夜，10％小牛血清封闭过夜，加入上述提取的样品SP-A，加入酶标抗体，37℃孵育1h，PBS洗板条，显色，判定结果。 结果 本实验Ⅰ期和Ⅱ期病人可提取粗品磷脂分别是每人次222.92±26.04mg和121.31±29.62mg，Ⅰ期多于Ⅱ期病人。两组SP-A分别是每人次提取87.21±17.23mg和56.97±13.44 mg，也是Ⅰ期多于Ⅱ期病人。两组比较P分别为0.000和0.007，有统计学意义。 显微镜检Ⅰ期和Ⅱ期病人肺灌洗液中细胞成分和比例，Ⅰ期病人肺灌洗液中嗜中性粒细胞占有核细胞总数的64.04±10.35％，显著多于Ⅱ期病人。Ⅱ期病人有核细胞中巨噬细胞占59.76±12.78％，显著多于Ⅰ期病人。两组比较P分别为0.001和0.000，巨噬细胞和嗜中性粒细胞占有核细胞总数的比例差异有统计学意义。 结论 在早期矽肺病人大容量肺灌洗液中提取PS是可行的。在Ⅰ期病人肺内嗜中性粒细胞较多，Ⅱ期巨噬细胞较多。相信在各自的期别具有各自介导炎性反应的途径。 第二部分正交实验设计优选大容量矽肺病人灌洗液粗提PS的条件 目的 筛选从矽肺病人双肺大容量灌洗(Whole-Lung Lavage，WLL)回收液体中粗提人源性肺泡表面活性物质(Hominine Pulmonary Surfactant，HPS)的方法。 方法 以HPS的获得量为指标，采用正交实验设计。一个人的双肺灌洗回收液均分9份。筛选不同初离心条件、不同孔径透析袋浓缩、不同高速离心条件和不同化学试剂萃取，共9次实验。 结果 以初离心：3000g，15min；3KD孔径透析袋浓缩；高速离心条件10000g，15min；化学试剂正丁醇萃取为最佳条件。利用该条件从6人单肺灌洗液(共72000ml)中提取了PS粗品7968.6222mg。 结论 该方法克服了矽肺病人肺灌洗液大容量和吸入金属物极多的问题，可以用来粗提HPS。 第三部分凝胶色谱提纯HPS 目的 利用凝胶色谱提纯HPS粗品。 方法 摸索提纯HPS条件，制备SEPHROSE凝胶色谱柱。 结果 提取HPS色谱条件：层析柱：Sephadex LH-20凝胶层析柱(15mm×400mm)。把正丁醇萃取的粗品PS用氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)溶解后上样。流动相：氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)，流速：1.0ml／min；收集220nm滤片以PC为主峰液体。将收集液旋转蒸发，40℃，15min，乙醇洗出，超净台抽风吹干，得到纯品HPS。水浴温度为44℃。 纯化的HPS纯品12646.76 mg。 结论 本产品天然HPS纯序高。实验方法可行。 第四部分HPS化学成分分析 目的 分析和比较HPS和其他PS制剂的化学组分。 方法 1 HPS的各组分含量测定：总磷脂含量测定采用硫酸—过氯酸消化孔雀绿显色法；蛋白质含量测定采用考马斯亮兰法、胆固醇和甘油三酯含量测定均按酶比色法进行操作。 2 HPS中磷脂的各组分分析：采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Phase Chromatography，HPLC)。 3所得数据用SPSS10.0统计软件进行分析。 结果 1 8例病人肺灌洗液共约192000ml。利用前述离心、透析、萃取、色谱提纯的方法，8例病人总共提取12646.76mg。HPS产物中各化学成分分别为：磷脂(95.74±1.95)％，甘油三脂(1.09±0.69)％，胆固醇(1.02±0.21)％，蛋白质(2.15±1.03)％。 2 HPS的各磷脂组分的构成比为：磷脂酰胆碱PC(80.43±5.05％)、磷脂酰甘油PG(6.67±0.45％)、磷脂酰乙醇胺PE(6.78±2.02％)、磷脂酰肌醇PI(3.77±2.20％)、磷脂酰丝氨酸PSE(2.35±1.61％)。HPS中磷脂含量达到95％以上其中PC含量达到80.43％，而TC、TG、蛋白质含量均较低，磷脂酰胆碱含量较高且磷脂成分比较齐全，说明HPS中磷脂成分较齐全，符合PS制剂的要求。 3本实验所采用的HPLC，各磷脂组分的保留时间和峰面积的重复性好、精密度高，可用来动态分析生产过程中各磷脂组分的含量，在HPS制备过程中和制备后及时分析是确保产品质量可靠性的关键，对提高HPS的生产质量具有重要意义。 结论 本研究制备的HPS产物中化学组分含量和磷脂组分的构成符合PS制剂标准。 第五部分亲和层析提纯SP-A 目的 提取矽肺病人灌洗液中的SP-A。 方法 制备亲和层析柱，摸索提纯SP-A的条件。利用ELISA法鉴定SP-A。利用色谱谱图计算SP-A含量。和光度计测定的总蛋白含量对比，计算产物的纯度。 结果 本方法每人次提纯SP-A含量为1.3692±0.3885g。纯度达到92.20±7.00％。对SP-A制备的方法和工艺过程进行了研究，确定了制备SP-A的最佳条件为：提纯：制备Sepharose 4B-抗人SP-AmAbs亲和层析柱：(15mm×400mm)。0.1Mol／LpH2.4甘氨酸—HCl缓冲液，流速1ml／min，收集解吸附下来的成分，沈出液OD_(280)＜0.02为止。立即以1Mol／LNaHCO_3中和到pH7.0，以免蛋白变性。 结论 萃取、透析和色谱分离的方法在大容量肺灌洗液体提取SP-A可行。用萃取、透析和色谱分离的方法能较好地提纯肺表面活性物质蛋白A。 第六部分肺表面活性物质的体外活性测定 目的 了解HPS的表面活件特征和加入SP-A后的效果。 方法 1采用JM04动态膜压记录仪测定HPS的表面活性特征。 2所得数据用SPSS10.0统计软件进行分析。 结果 测得代表HPS降低表面张力和膜稳定性的指标如下：蒸馏水表面张力改变的数量，压缩80％再张开到原有面积，由原先的14.16±2.07mN／m变化到1.13mN／m，变化幅度达到13.04±0.40mN／m。加入HPS 50ul后，由21.38±2.20mN／m降低到0.74±0.08mN／m，变化幅度达到20.64 mN／m。较大地改变了膜表面张力。给蒸馏水加入HPS+SP-A后，表面张力在膜表面积压缩和张开过程中，由25.67±2.91mN／m降低到0.51±0.17mN／m，降低幅度达到25.16mN／m。较前明显改变了膜表面张力。三组数据方差分析显示组间均数均有差异，P为0.000，差异有统计学意义。 结论 本方法提纯的HPS纯品具有改变蒸馏水表面张力作用，在膜压缩过程中保持稳定性。加入SP-A，在蒸馏水表面膜压缩过程中，降低表面张力的作用优于单纯HPS制品。提示SP-A优化了HPS在蒸馏水表面的分布，进一步降低了膜表面张力。因此，本法提取的HPS和SP-A可用于人与动物实验和临床替代治疗的应用和研究。 HPS制剂加入蒸馏水后可有效降低表面张力，具备PS的表面活性特征。SP-A可以协助HPS进一步降低表面张力。 第七部分矽肺病人和肺泡蛋白沉积症一例肺灌洗液HPS水平比较 目的 侧证矽肺病人不同时期HPS水平变化。 方法 利用前述提取HPS和SP-A方法，提取矽肺病人24人(灌洗液12000ml／人)和肺泡蛋白沉积症一例肺灌洗液(27000m1)中HPS和SP-A并比较之。 结果 该PAP病人肺内HPS、蛋白质、SP-A的水平均较Ⅰ期矽肺病人高2-3倍之多。达到HPS 287.4mg／l，Protein 4.42g／l，SP-A 2.89g。Ⅰ期矽肺病人各项数据分另4是HPS 137.13±17.40mg／l，Protein 1.62±0.45 g／l，，SP-A 0.95±0.20g。相对而言，矽肺病人肺内堆积的表面活性物质含量不足该例PAP病人的30％。Ⅱ期HPS32.6±3.89 mg／l，Protein0.98±0.39g／l，SP-A0.61±0.16g，Ⅲ期HPS29.9±6.43mg／l，Protein 0.43±0.11g／l，SP-A 0.52g±0.23g。矽肺病人肺内堆积的表面活性物质逐期下降。三期数据方差分析显示组间均数均有差异，P为0.000，差异有统计学意义。 结论 矽肺发病初期，表面活性物质大量堆积。但是数量仅为该PAP病人肺泡内表面活性物质堆积数量的30％。随期别增加，肺内堆积的表面活性物质水平下降。 第八部分大容量肺灌洗后肺内PS恢复情况 目的 了解全肺大容量灌洗术术后肺内HPS水平变化。 方法 给矽肺病人行全肺大容量灌洗，鉴定术后不同时间肺内洗出液体的HPS浓度，了解术后HPS的变化。间接反映肺泡Ⅱ型细胞代偿性分泌HPS增加的情况。 结果 三个时间段的数据方差分析显示组间均数均有差异，P为0.000，差异有统计学意义。提示三期病人三个时间段比较都有恢复。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺病人肺内PS水平分别在263.4±20.37mg／l、183.8±19.34mg／l、77.7±01.94mg／l。以此为基础，没有继续灌洗(丢失)，Ⅰ期矽肺病人术后10分钟检测肺内PS水平即达到460.4±22.03mg／l，30分钟达到842.8±34.17mg／l，P为0.000。Ⅱ期矽肺病人术后10分钟检测肺内PS水平达到191.2±18.9mg／l，术后30分钟达到425.8±20.04mg／l，与术后即时水平比较P均为0.000。Ⅲ期矽肺病人术后30分钟检测肺内PS水平达到81.5±03.40mg／l，与术后即时77.7±01.94mg／1的水平比较P为0.000，虽有统计学意义，表明出现代偿，但是总体水平仍然高出不多，不能明显改善病人灌洗后呼吸困难的情况，不能起到多少实际效果。 结论 灌洗可以引起PS丢失。但I期矽肺病人灌洗后可以在很短时间(＜10min)出现代偿并恢复肺内PS水平。Ⅱ期矽肺病人PS丢失，10min左右还没有出现明显代偿情况。大约30min出现代偿并恢复肺内PS水平。Ⅲ期矽肺病人术后30分钟出现了代偿但无实际意义。 小结 1本研究运用ELISA方法和离心方法初步验证了大容量肺灌洗液中含有高水平的HPS、SP-A。 2本研究优选了透析、化学萃取和离心的最佳条件为：以初离心：3000g，15min；3KD孔径透析袋浓缩，高速离心条件10000g，15min；化学试剂正丁醇为最佳条件。利用该条件从6人次单肺灌洗液(各12000 ml)中提取了PS粗品7968.6222mg。 3本研究利用透析、化学萃取、色谱提纯方法分离提取HPS，获得提纯的HPS12646.76 mg。对HPS纯品制备的方法和工艺过程进行了研究，确定了制备HPS的最佳条件为：提纯：层析柱：Sephadex LH-20凝胶层析柱(15mm×400mm)。把正丁醇萃取的粗品PS用氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)溶解后上样。流动相：氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)，流速：1.0ml／min；收集220nm滤片以PC为主峰的液体，将收集液旋转蒸发，44℃，15min。乙醇洗出，超净台抽风吹干，得到纯品PS，水浴温度44℃。 4本研究分析了HPS制剂的化学组分和磷脂的各组分。8例病人肺灌洗液共约192000ml。利用离心、透析、萃取、色谱提纯的方法，8例病人总共提取12646.76mg。人均提取HPS为1580.85mg。HPS产物中各化学成分分别为：磷脂(95.74±1.95)％，甘油三脂(1.09±0.69)％，胆固醇(1.02±0.21)％，蛋白质(2.15±1.03)％。 HPS的各磷脂组分的构成比为：磷脂酰胆碱PC(80.43±5.05％)、磷脂酰甘油PG(6.67±0.45％)、磷脂酰乙醇胺PE(6.78±2.02％)、磷脂酰肌醇PI(3.77±2.20％)、磷脂酰丝氨酸PSE(2.35±1.61％)。HPS中磷脂含量达到95％以上，其中PC含量达到80.43％，而TC、TG、蛋白质含量均较低，磷脂酰胆碱含量较高且磷脂成分比较齐全，说明HPS中磷脂成分较符合人体需要。 5本研究利用色谱提纯方法分离提取SP-A。对SP-A制备的方法和工艺过程进行了研究，确定了制备SP-A的最佳条件为：提纯：制备Sepharose 4B-抗人SP-AmAbs亲和层析柱：(15mm×400mm)。0.1Mol／L pH2.4甘氨酸—HCl缓冲液，流速1ml／min，收集解吸附下来的成分，洗出液OD_(280)＜0.02为止。立即以1Mol／L NaHCO3中和到pH7.0，以免蛋白变性。本方法每人次提纯SP-A含量为1.3692±0.3885g。纯度达到92.20±7.00％。萃取、透析和色谱分离的方法在大容量肺灌洗液体提取SP-A可行。用萃取、透析和色谱分离的方法能较好地提纯肺表面活性物质蛋白A。 6测得代表HPS降低表面张力和膜稳定性的指标如下：蒸馏水表面张力改变的数量，压缩80％再张开到原有面积，由原先的14.16±2.07mN／m变化到1.13±0.40mN／m，变化幅度达到13.03mN／m。加入HPS 50ul后，由21.38±2.20mN／m降低到0.74±0.08mN／m，变化幅度达到20.64 mN／m。较大地改变了膜表面张力。给蒸馏水加入HPS+SP-A后，表面张力在膜表面积压缩和张开过程中，由25.67±2.91mN／m降低到0.51±0.17mN／m，降低幅度达到25.16mN／m。较前明显改变了膜表面张力。本方法提纯的HPS纯品加入蒸馏水后可有效降低表面张力，具备PS的表面活性特征。SP-A可以协助PS进一步降低表面张力。 7本文比较了矽肺病人和肺泡蛋白沉积症的患者HPS、SP-A水平。该PAP病人肺内HPS、蛋白质、SP-A的水平均较Ⅰ期矽肺病人高2-3倍之多。达到HPS287.4mg／l，Protein 4.42g／l，SP-A 2.89g。Ⅰ期矽肺病人各项数据分别是HPS137.13±17.40 mg／l，Protein 1.62±0.45 g／l，SP-A 0.95±0.20g。相目对而言，矽肺病人肺内堆积的表面活性物质含量不足该例PAP病人的30％。Ⅱ期HPS32.6±3.89mg／l，Protein 0.98±0.39g／l，SP-A0.61±0.16g，Ⅲ期HPS29.9±6.43mg／l，Protein 0.43±0.11g／l，SP-A 0.52g±0.23g。矽肺病人肺内堆积的表面活性物质逐期下降。 矽肺发病初期，表面活性物质堆积。但是数量仅为PAP病人肺泡内表面活性物质堆积数量的30％。随期别增加，各种物质含量持续下降。 8三期病人术后三个时间段(0、10、30min)比较PS水平都有恢复。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺病人肺内PS水平分别在263.4±20.37mg／l、183.8±19.34mg／l、77.7±01.94mg／l。以此为基础，没有继续灌洗(丢失)，Ⅰ期矽肺病人术后10分钟检测肺内PS水平即达到460.4±22.03mg／l，30分钟达到842.8±34.17mg／l，P为0.000。Ⅱ期矽肺病人术后10分钟检测肺内PS水平达到191.2±18.9mg／l，术后30分钟达到425.8±20.04mg／l，与术后即时水平比较P均为0.000。Ⅲ期矽肺病人术后30分钟检测肺内PS水平达到81.5±03.40mg／l，与术后即时77.7±01.94mg／1的水平比较P为0.000，虽有统计学意义，表明出现代偿，但是总体水平仍然高出不多，不能明显改善病人灌洗后呼吸困难的情况，不能起到多少实际效果。 灌洗可以引起PS丢失，但Ⅰ期矽肺病人灌洗后可以在很短时间(＜10min)出现代偿并恢复肺内PS水平。Ⅱ期矽肺病人PS丢失，10min左右还没有出现明显代偿情况。大约30min出现代偿并恢复肿内PS水平。Ⅲ期矽肺病人术后30分钟出现了代偿但无实际意义。
【图文】：

6398士9134.22士6.5864.04士6485士6759.76士12.7826.81士1.8934.3528.190.0880.0010.00沉淀显微镜检见图1一1、图1一2论矽肺机理研究已有较大的进展，矽尘进入肺泡后，以炎性细胞为分泌的趋化因子、氧自由基和细胞因子，导致肺泡炎和纤维化。质是磷脂与表面活性蛋白共同组成复合物，SP一A是4种表面活性蛋表面活性物质由n型肺泡上皮细胞合成和分泌，对维持肺的正常的生理学意义。动物实验表明，矽尘可引起SP一A增加，伴有肺H型协一护

第三部分凝胶色谱纯化PS洗脱流速应根据情况而定，最大流速约5耐/min，建议流速为2ml/min。较低的流速，具有较高的分辩率。按0D二〔，出峰收集所要的磷脂。1.2.6再生凝胶再生通常是先用2一3个柱体积的洗脱液进行清洗。2结果8例病人肺灌洗液共约192000ml。利用前述离心、透析、萃取、色谱提纯的方法，析见下图8例病人总共提取HPS纯品12646.76mg。粗品、纯品色谱谱图对照分
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R341

【引证文献】

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1 刘红梅;涂健;潘玲;祁克宗;;猪亲水性肺表面活性蛋白及其天然免疫机制[J];中国预防兽医学报;2012年06期

本文编号：2551486