抗人APRIL单克隆抗体的制备及三种免疫检测方法灵敏度的比较

发布时间：2019-11-04 09:20

【摘要】： 增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand，APRIL)是1998年发现的TNF超家族的一个新成员。人APRIL编码基因定位于染色体17p13.1，mRNA全长2.1 kb。APRIL共250个氨基酸，属Ⅱ型跨膜蛋白，其主要作用是促进肿瘤细胞增殖，调节体液免疫，并参与T、B细胞的成熟和活化。它主要表达于免疫细胞，包括单核巨噬细胞、树突状细胞及T细胞，并且高表达于多种肿瘤细胞。 APRIL与TNF超家族中另一个成员B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF)的胞外区有48％的同源性，并且二者竞争性结合受体BCMA和TACI。已有研究证明，BAFF与相应受体结合引起的细胞内信号级联反应影响B细胞的存活，APRIL则通过结合B细胞上的BCMA和TACI调节B细胞增生。有文献报道，SLE患者血清中BAFF与APRIL的水平都明显升高，并与抗dsDNA抗体的出现相关。这些证据提示，APRIL／BAFF与BCMA／TACI形成的双受体一双配体系统，在SLE等自身免疫病的发生和发展过程中都起了重要作用。本文制备了抗人APRIL的单克隆抗体，为日后阐明APRIL的生物学意义及SLE等自身免疫病的发病机理提供了有利工具。 本论文包括两部分。在第一部分中，我们利用人的外周血单个核细胞的cDNA为模板，分别克隆了APRIL的全长、胞外区及其可溶形式，并将APRIL基因重组到原核表达载体pET-30a(+)的NdeⅠ和HindⅢ两酶切位点之间。阳性重组子在大肠杆菌BL21(DE3)及BL21-CodonPlus-RIL中进行IPTG诱导表达，诱导后的重组蛋白以包涵体形式出现，，经镍柱亲和层析纯化后，用来免疫小鼠制备抗人APRIL的单克隆抗体。进而，通过阳性检测及亚克隆筛选，得到分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，以便为后续研究奠定基础。 在第二部分中，通过比较三种免疫检测方法的灵敏度，为后免疫检测工作提供了参考。利用生物素—链亲和素放大系统的BA-ELISA，可以使双抗夹心ELISA的灵敏度大大提高，但有些抗体会因生物素标记导致活性降低，可能是由于生物素结合的位置正好是抗原结合位点或离抗原结合位点很近，从而影响了其活性。而将ELISA的酶显色转变为PCR产物检测的免疫PCR，也能大大提高ELISA检测的灵敏度，但由于步骤繁琐，易引起较大误差，从而限制了在国内的大规模应用。
【图文】：

图1.1人APRIL的氨基酸序列RIL主要由树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞分泌，以可溶性形式正常组织中表达弱，仅见于前列腺、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、结织，但在多种肿瘤组织(尤其是直肠、结肠、十二指肠、胃、食管)和肿瘤细胞系(如直肠癌细胞系sW480、淋巴瘤细胞系Raji、36等)中有高表达川。己确认的APRIL的2个受体是BCMA(Beellmaturationantigen)embraneaetivatorandCAMLinteractor)141。人BCMA是一个全长由的非糖基化单链蛋白，为I型跨膜蛋白，其胞外N端有一含6个半人TACI是一个全长为293个氨基酸的111型跨膜蛋白，N端无信为54%，最早是在研究钙调控因子和亲环素配体(calciulnmoduinhgand，cAML)蛋白介导的NF一AT活化机制中发现的。TACI胞

图1.2APRIL、BAFF及其受体发现APRIL可明显促进不表达BCMA和1’ACI的未活化一3T3和多种肿瘤细胞(如人腺癌细胞系HT29、肺癌A5验证明这些细胞对BAFF没有反应，这说明在这些细胞上存体，它不能与BAFF结合。2005年，Hendriks等发现了HSPG(heParansulfateprotcoglycan)，它可以促进肿瘤细细胞和B细胞161。通过上调X相关凋亡蛋白抑制因子(X一hnkedmarnrnaliein，XIAp)和诱导Bel一2和Bel一xl表达增加促进某些肿瘤。研究发现sAPRIL在体外以剂量依赖方式促进人直肠巴瘤细胞株Raji等肿瘤细胞增殖。将转染APRIL基因的RIL基因的NIH一3T3细胞接种到裸鼠体内，前者较后者的
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392;R446.6

【参考文献】

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1 陈志强,李子仁,范江,岳晓玉,徐文严;系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞中Th1型细胞因子的表达[J];中华皮肤科杂志;1999年01期

本文编号：2555578