CD59基因突变与细胞凋亡信号转导的相关性研究

发布时间：2019-11-06 06:48

【摘要】：目的 通过转基因技术构建表达人突变CD59蛋白的重组真核表达载体,建立突变人CD59真核表达系统,获得高效表达突变人CD59蛋白的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)细胞株。经凋亡相关基因--Fas、Bcl-2、NF-кB的表达情况,证实突变人CD59在细胞凋亡信号转导中的作用,为肿瘤免疫逃逸机理的研究提供依据。 方法采用基因定点突变技术构建CD59突变基因,设计互补突变引物和常规引物,以已构建CD59cDNA重组质粒为模板,重组PCR定点诱变扩增突变基因,EcoRI酶切重组入真核表达质粒pALTER-MAX。利用阳离子脂质体(Lipofectamine-2000)导入法将含有突变人CD59的重组pALTER-MAX质粒与PcDNA3质粒共转染中国仓鼠卵巢细胞进行表达,用新霉素类似物G418筛选稳定转染细胞克隆。通过荧光免疫组化(FIH)、酶免疫组化(EIH)、流式细胞仪法(FACS)和免疫印迹技术(Western blot)检测筛选CD59突变基因高表达株。经免疫组织化学染色试验检测转染前后CHO细胞凋亡相关基因--Fas、Bcl-2、NF-кB的表达情况。 结果 PCR定点诱变成功获得目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定均证实成功构建了pALTER-MAX-突变CD59重组真核表达载体系统。运用阳离子脂质体介导法将含有突变人CD59的pALTER-MAX重组质粒与PcDNA3共转染入CHO细胞,用含有400ug/mlG418的RPMI1640培养基培养两周,筛选出稳定阳性表达克隆,继续培养扩增获得稳定表达细胞株。筛选出的阳性克隆细胞以荧光抗体技术、免疫酶标技术检测,表明在细胞膜表面有突变人CD59分子的表达。流式细胞术进一步检测并
【图文】：

插入的基因片段为49b5p，故重组pALI王R一MAX一突变CD59长约6kb。EocRlI酶切重组质粒后于sooPb处见一条带(图1)，，从而确定所构建质粒转化扩增成功。1234520X()PbInnn卜”75b0P500bP25b0P10b0P_495bP图1重组质粒pATLEReeMAX一突变CD59的酶切鉴定:DNADI田火er2:pATLE-RMAX一突变CD59重组质粒3:EcofRI酶切pALTE-RMAx一突变CD59重组质粒:4pALTE-RMAx一突变CD59重组质粒:5Ec。很I酶切pALTER.MAx一突变CD59重组质粒二、重组质粒转染CHO细胞后经以18筛选的阳性克隆

重组质粒转染HCO细胞经G418筛选两周后形成的阳性克隆(lX)
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

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本文编号：2556593