【摘要】： 目的:脑胶质瘤是最常见并且多发的中枢神经系统恶性肿瘤。传统的手术、化疗和放疗等手段的疗效均不是很理想[1]。胶质瘤细胞动力学研究表明,由于肿瘤呈浸润性生长,有相当一部分肿瘤处于暂时静息状态,即使切除了99%的肿瘤组织,8周后就可增殖恢复到原来的大小。随着细胞生物学、分子生物学及生物工程技术的发展,给脑胶质瘤的治疗带来了新的希望。其中抗体介导的免疫诊断治疗已成为肿瘤治疗研究的热点之一[2]。 所谓IgY抗体就是一种从卵黄中提取的具有特殊生物学功能的免疫球蛋白[3]。由于鸡属于非哺乳动物,与人类亲缘关系较远,故它对人类的病原体具有强免疫应答。胶质瘤IgY抗体能特异而选择性的识别脑胶质瘤组织,因此它可以作为一种小型而高效的导向载体把毒素有目的地运输到肿瘤细胞上,当载体识别肿瘤细胞后,立即与肿瘤细胞结合而释放毒素,从而达到杀死肿瘤细胞而不影响其它正常细胞的目的[4]。此外IgY的制备成本低且产量高,亦无毒副作用,将成为大规模抗体制备的一种有效手段。本研究旨在制备人脑胶质瘤细胞系U251 IgY抗体,并对其基本特性进行分析、鉴定,从而为脑肿瘤的诊治提供新的思路。 方法:1.第四军医大学西京医院神经科学研究所惠赠的人脑胶质瘤细胞系U251,于37℃、5% CO2条件下常规培养、传代。 2.本研究所用的实验动物为购于辽宁省辽阳益康生物制品厂的京白鸡,正常饲养一周后,准备用于免疫。 3.收集长势良好的U251细胞用生理盐水配制成悬液,按照109个细胞/只鸡免疫产蛋京白鸡,初次免疫时需要加入等量的福氏完全佐剂,分别于双翅膀皮下,左右背部皮下进行点注射。免疫一周后,逐日收集其所产的蛋,标记好时间,4℃保存备用。 4.本研究以免疫前及免疫后第15、20、25、30、35、40、45天收集到的鸡蛋为研究对象,去除蛋清,收集卵黄液经过蒸馏水粗提,50%饱和硫酸铵盐析,透析、以及聚乙二醇浓缩等步骤得到纯化的IgY抗体[5],这里我们将其命名为AG-IgY(Against glioma IgY)。蛋白质定量后,再通过免疫组织化学、免疫细胞化学、SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对所提抗体进行鉴定。 结果:经抗原免疫的母鸡,10天左右就可从其所产蛋的卵黄中检测出特异性IgY抗体,抗体量在35天左右达到高峰,每个鸡蛋可收获100～200mg抗体。其热稳定性、耐酸性均较好,效价可以持续2～6个月。免疫细胞化学染色显示,AG-IgY抗体与U251胶质瘤细胞呈强阳性反应,阳性部位主要位于细胞膜及细胞质。经纯化的AG-IgY通过还原性SDS-PAGE显示两条带,其分子量约为70kD和20kD。ELISA结果显示,IgY与肝癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤细胞U87等其他抗原之间无交叉反应。Western blot检测所得结果完全相同。 结论:1.本实验成功制备获取了抗人脑胶质瘤的IgY抗体。 2.通过对其理化性质、SDS-PAGE、Western blot以及ELISA的研究结果表明, AG-IgY抗体是一种耐酸、耐热、成本低、产量高并且制备简便的新型抗体。其特异性较强,与无关抗原无交叉反应。 3.本研究将为人脑胶质瘤的诊治提供新的研究手段。
【图文】：
转印“三明治”示意图
AG-IgY抗体的免疫组化阳性结果，100×
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R739.41;R392
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6 刘U，
本文编号：2559033
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