巨噬细胞甘露糖受体siRNA体系的建立及对壳寡糖与巨噬细胞结合的影响

发布时间：2019-11-19 03:45

【摘要】： 【背景和目的】 几丁质又称甲壳素，在昆虫、甲壳类动物外骨骼、真菌细胞壁及某些绿藻中广泛存在，，是自然界中仅次子纤维素的含量最丰富的生物资源。几丁质及其部分脱乙酰化产物壳聚糖具多种生理功能，如抑瘤、抗菌、免疫增强等。但是他们的高粘度和低水溶性极大地限制了其在体内的应用。于是低分子量的降解产物壳寡糖以其良好的水溶性和无毒性及良好的组织相容性日渐受到重视。 已有文献报导壳寡糖在整体动物实验中能激活巨噬细胞，增强其杀伤活性，并诱导如白介素—1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒单核集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-6(IL-6)等细胞因子的分泌，增强T细胞和NK细胞的活性。但壳寡糖与巨噬细胞的结合机制，特别是关于壳寡糖在巨噬细胞表面的受体报导甚少。 本实验室前期将甘露聚糖(甘露糖受体的配体)用荧光物质进行标记，观察其在其它甘露糖受体的竞争性抑制剂及壳寡糖存在的情况下，与小鼠RAW264.7巨噬细胞的结合情况。实验结果表明壳寡糖可竞争性抑制巨噬细胞内吞甘露聚糖，抑制作用强达44％。 本实验进一步使用RNA干扰的方法，沉默甘露糖受体在RAW264.7巨噬细胞中的表达，从而研究壳寡糖与巨噬细胞结合情况。 【材料和方法】 (一)PGCsi-U6／Neo／DsRed质粒载体的构建 1．设计siRNA：采用Ambion公司siRNA在线软件设计3条靶序列和1条打乱部分碱基顺序的随机阴性对照序列。 2．合成DNA oligos，此DNA oligos含有靶基因的siRNA序列。 3．用BamHⅠ和HindⅢ酶切pGCsi载体以使其线性化。 4．将DNA oligos接入载体。 5．测序鉴定确定构建成功。 6．将载体转导入DH5α细菌中扩增并纯化。 7．将pGCsi载体转染入RAW264.7巨噬细胞表达。 8．检测ERFP的荧光。 9．检测mRNA及蛋白水平的基因抑制效率。 (二)异硫氰酸荧光素(FITC)标记壳寡糖 将壳寡糖溶于醋酸缓冲溶液(0.2 mol／L CH_3COOH+O.1 mol／L CH_3COONa)调整其pH值至7.7，定容得到1％壳寡糖溶液。取10ml此溶液，室温下150rpm振荡恒温30min后，迅速加入一定量的FITC溶液(溶剂为甲醇)，具塞，继续以同样振荡速度在4℃条件下反应24小时。离心取上清，装入截留的相对分子质量为1000的透析袋内置PH 7.4的PBS中4℃避光透析，每天更换PBS三次，直至透析外液在紫外照射下无荧光为止。冷冻干燥后溶解在c-PBS缓冲液中。取少量，测标记物的荧光物质(F)与蛋白(P)结合比率F／P=OD 495nm／OD 280nm，确定糖的标记效率。 (三)流式细胞仪分析FITC标记的壳寡糖与巨噬细胞结合显示的荧光强度 在培养瓶(或培养板)中加入一定量的溶于c-PBS的FITC标记的壳寡糖，避光孵育特定时间。用刮除法将贴壁的巨噬细胞制成细胞悬液，3000rpm离心5分钟去除未结合的FITC标记的壳寡糖，后重新悬浮于c-PBS缓冲液中，调整细胞浓度为1×10~6／ml。结合了FITC标记的壳寡糖的细胞的荧光强度用BD-LSR流式细胞仪的Cell Quest软件检测。 【结果】 1．成功构建抑制巨噬细胞甘露糖受体的siRNA质粒表达载体Mrc1-1、Mrc1-2、Mrc1-3和打乱序列的阴性对照Non质粒； 2．Mrc1-1质粒、Mrc1-2质粒、Mrc1-3质粒显著抑制甘露糖受体在巨噬细胞RAW264.7上的表达； 3．Mrc1-3质粒干扰后巨噬细胞与壳寡糖结合明显下降。 【结论】壳寡糖可以通过甘露糖受体与巨噬细胞结合。
【图文】：

RAW264.7巨噬细胞选用DMEM培养液进行贴壁生长培养，生长状况良好，形态佳，一般其大小在20一 50um，有特殊的细胞核和皱褶的细胞质，呈圆形、星形或梭形。见图4。

2007浙江大学硕士学位论文白水平干扰效率检测结果质粒转染72小时后，加标记FITC的抗甘露糖受体抗体，，未转染组细胞结合抗体后荧光强度为3.76，转染Mrcl一荧光强度为1.27，转染Mrcl一2质粒组细胞结合抗体后荧rcl一3质粒组细胞结合抗体后荧光强度为1.23，而转染无关结合抗体后荧光强度为3.71，见图6。结果表明，Mrcl一Mrcl一3质粒均明显抑制甘露糖受体的表达，其中Mrel一3质粒关序列质粒Non质粒对甘露糖受体的表达无显著影响。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

【引证文献】

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1 殷黎晨;用于改善生物大分子药物功效的超多孔水凝胶、纳米粒新型给药载体[D];复旦大学;2010年

本文编号：2562905