应用AdEasy腺病毒载体系统构建携带人骨形成蛋白2基因的重组腺病毒

发布时间：2019-12-03 06:57

【摘要】：目的:利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带hBMP2基因的重组腺病毒载体,应用于hBMP2基因治疗和在骨组织工程中对种子细胞进行基因改造,促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。 方法:常规CaCl2法制备E. coli DH5α感受态细菌,pcDNA3-hBMP2质粒转化E. coli DH5α感受态细菌。维特洁DNA小量纯化试剂盒抽提pcDNA3-hBMP2质粒,限制性内切酶XbaI、KpnI酶切,酶切产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,1.0%琼脂糖凝胶电泳结果与理论上pcDNA3-hBMP2质粒多克隆位点图谱吻合;将pcDNA3-hBMP2送交上海申友公司进行双向测序,hBMP2基因序列与已报告的hBMP2基因序列吻合。pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒转化E. coli DH5α感受态细菌,维特洁DNA小量纯化试剂盒抽提pAdTrack-CMV质粒,限制性内切酶XbaI、KpnI、PacI酶切,酶切产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,1.0%琼脂糖凝胶电泳结果与理论上pAdTrack-CMV质粒多克隆位点图谱吻合。pcDNA3-hBMP2质粒和腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV经KpnI和XbaI双酶切,凝胶回收试剂盒回收hBMP2基因片断和pAdtrack-CMV载体片断,回收的载体片断和目的基因片断T4 DNA Ligase进行酶连反应。酶连产物转化E. coli DH5α感受态细菌,维特洁DNA小量纯化试剂盒抽提重组pAdtrackCMV-hBMP2穿梭质粒,PmeI、PacI、BamHI酶切,酶切产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与pAdTrackCMV-hBMP2质粒预期理论酶切位点相吻合,证明获得正确的重组pdTrackCMV-hBMP2质粒。参照Gene PulSeE XcellTM Instruction Manual(电转仪操作手册)制备E coli
【图文】：

有时看不到。进行单酶切的质粒，超螺旋状质粒DNA线性化，速度稍慢。进行双酶切的质粒，因为质粒切下一段基因片断，质粒分子量较单酶切变小，速度又变快，并且可以看到两条带。我们的酶切电泳结果(图1一2)与理论吻合。

APdTrack一CMV质粒包含外源基因插入的多克隆位点，其中还插入了GFP表达单位和Karamycin抗性基因，，左臂和右臂包含核昔酸序列介导与pAdEasy一1质粒的同源重组。人工在左右臂创建Pac工酶切位点(图2一1)。图2一1:1:pAdTrack一CMV质粒图谱;2:Kpnl，Xbal酶切插入基因位置fiZg一1.1，themPaofPAdTrack一CMVPlamsid:2，thesiteofinesrtbyKPnland勘al我们对pAdTraek一CMV质粒在DH5a菌中进行扩增并经Kpnl和Xbal双酶切鉴定及Pacl酶切鉴定。实验试剂与仪器设备同第一章。第一节pAdTrack一C柳质粒转化DH5a化学感受态菌一pAdTraek‘eMv质粒转化oHS。化学感受态菌1一70℃解冻DH5a化学感受态菌，无菌吸头吸取200pl感受态细胞悬液，分装3个EP管，编号l、2、3，立即置冰上。2.1管加入pAdTraek一CMV质粒DNA溶液(2pl)
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R346

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 柳林,刘银萍,潘欣,孙琰,徐琪,沈炜,刘志勇;血管内皮细胞生长抑制因子VEGI_(151)重组腺病毒对角膜新生血管的抑制作用[J];眼科研究;2005年03期

2 王耿,何国祥,冉擘力,张萍,景涛,陈渝;腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响[J];第三军医大学学报;2005年14期

3 孙运祥,任丽君,郭玉嵩,田长富;人IL-2复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定[J];实用肿瘤学杂志;2005年04期

4 陈静韵,丁焕文,王捷,杨汝德;用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建[J];华南理工大学学报(自然科学版);2005年08期

5 廖洪映;熊利华;陈波;张惠忠;华平;殷香保;祝曙光;傅玉如;;重组bcl-xL腺病毒对心肌细胞凋亡的影响[J];中山大学学报(医学科学版);2005年04期

6 吴红兵;田聆;文艳君;刘玉梅;阚兵;杜小波;徐健蓉;魏于全;;表达人CD40配体的重组腺病毒载体的构建[J];华西口腔医学杂志;2005年06期

7 吴燕峰;王鹏;唐勇;黄霖;杨睿;史玉朋;贺晓玉;沈慧勇;;复制缺陷型重组腺病毒Adeno-X-脑源性神经营养因子的构建与鉴定[J];中华实验外科杂志;2006年05期

8 张毅;杨占宇;朱瑾;杨世忠;李晓武;董家鸿;;连环蛋白P120基因重组腺病毒载体的构建及表达[J];第三军医大学学报;2006年17期

9 吕金星;严春寅;侯建全;浦金贤;平季根;温端改;;人血红素氧合酶-1重组腺病毒的构建与鉴定[J];江苏医药;2006年11期

10 邵紫韫;刘志锋;彭毅;徐佳;邓鹏;姜勇;;IP-10重组腺病毒载体的构建及其病毒制备[J];南方医科大学学报;2006年11期

相关会议论文 前10条

1 王晋慧;姚明忠;顾锦法;孙兰英;郎明非;刘菁;刘新垣;;肿瘤靶向性腺病毒载体的构建[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

2 刘旭;田长富;;癌基因治疗中的腺病毒载体的开发和应用(综述Ⅱ)[A];庆祝黑龙江省免疫学会成立十周年（1993—2003）论文集[C];2003年

3 凌昌全;李绍祥;张晨;张亚妮;;携蜂毒素基因腺病毒载体的构建及体外抑瘤实验研究[A];第九届全国中西医结合肿瘤学术研讨会论文集[C];2002年

4 马立新;马琪;徐松;;新型、简捷、有效的方法构建基于腺病毒载体系统的cDNA表达文库[A];中国蛋白质组学首届学术大会论文摘要集[C];2003年

5 王桂兰;鲁继荣;成焕吉;马青山;张云峰;;高滴度含有目的基因IL-4RA的逆转录病毒的包装和浓缩[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

6 吴运谱;张晓华;乔传玲;;腺病毒载体流感疫苗研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

7 刘金娟;马翔;;小鼠HSP27基因腺病毒表达载体的构建与鉴定[A];第四届长三角妇产科学术论坛暨浙江省2009年妇产科学术年会论文汇编[C];2009年

8 刘潇聪;陈耀凯;;腺病毒体外介导CTLA4-Ig在L02细胞中的表达及其生物学活性[A];全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编[C];2010年

9 张春燕;李方和;龚劲松;陈妍;;抗腺病毒载体单克隆抗体的制备及其初步鉴定[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

10 张子阳;袁春玉;杨亦彬;;人促血管生成素1腺病毒载体的构建[A];贵州省医学会肾脏病学分会2008年学术年会论文汇编[C];2008年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 李天舒　通讯员 朱丹萍;一研究证实腺病毒载体依然是安全的[N];健康报;2011年

2 本报记者 刘松柏;基因治疗的探路者[N];经济日报;2010年

3 火言;疫苗研发全球赛跑[N];中国质量报;2003年

4 万同己;P53基因与肿瘤基因治疗[N];中国医药报;2004年

5 麦迪信;糖尿病基因疗法初见成效[N];医药经济报;2003年

6 加闻;加拿大非典疫苗研究获新进展[N];医药经济报;2003年

7 翁维良：中国中医研究院首席研究员，中国中西医结合学会活血化瘀学会副主任委员，内科主任医师，博士生导师;心血管病基因疗法[N];中国中医药报;2000年

8 记者 毛磊;肌营养不良基因法可疗[N];新华每日电讯;2002年

9 王俊鸣;接种疫苗的猴子产生免疫反应[N];科技日报;2003年

10 记者 王雪飞;支架+转基因可减少心脏介入术后血管再狭窄[N];健康报;2000年

相关博士学位论文 前10条

1 扈江伟;腺病毒介导hTRX修饰的间充质干细胞在小鼠急性放射损伤中的修复作用研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年

2 张燕玲;脑源性神经生长因子前体ProBDNF在大鼠后足切割痛的作用及可能机制研究[D];中南大学;2012年

3 吴成君;Ad35腺病毒载体构建及病毒蛋白免疫原性研究[D];北京协和医学院;2009年

4 于彬;六邻体嵌合型重组5型腺病毒载体逃避预存免疫的研究[D];吉林大学;2012年

5 席启林;维生素D受体调控尿钙重吸收的分子机制研究[D];华中科技大学;2010年

6 徐尤年;血管生成素1腺病毒载体的构建及其对内毒素性肺损伤炎症消退的影响[D];华中科技大学;2010年

7 陈剑;BMP2和BMP7基因共转染兔骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的实验研究[D];第二军医大学;2011年

8 王鹏;表达His-tag-ICP47融合基因腺病毒载体的构建及其免疫活性的研究[D];郑州大学;2011年

9 刁彦鹏;腺病毒载体介导转染CD基因抑制大鼠移植静脉内膜增生及其机制的实验研究[D];中国医科大学;2005年

10 张岩;腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶反义RNA抑制前列腺癌的实验研究[D];山东大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 苏秀云;应用AdEasy腺病毒载体系统构建携带人骨形成蛋白2基因的重组腺病毒[D];第一军医大学;2005年

2 陈媛媛;hIL-12腺病毒载体的构建及在人hBMSCs中的表达[D];山西医科大学;2010年

3 宋默;携带p53基因和Flt3L配体基因的腺病毒载体的构建及鉴定[D];大连医科大学;2010年

4 宋付凯;高表达hRAMP1基因腺病毒载体的构建及其在兔MSCs中表达的实验研究[D];遵义医学院;2010年

5 刘海斌;腺病毒介导的mda-7/IL-24基因对人喉癌细胞Hep-2的凋亡作用[D];第二军医大学;2010年

6 魏菁;腺病毒介导ChM-I基因抑制BMSCs体内构建的软骨血管化的实验研究[D];西北大学;2010年

7 刘海平;非增殖性腺病毒携带全长抗体Cetuximab的肿瘤基因治疗的研究[D];浙江理工大学;2010年

8 毛亮;选择增殖型腺病毒ZD55携带自杀基因Dm-dNK(果蝇脱氧核糖核苷酸激酶）治疗大肠癌的研究[D];中国医科大学;2010年

9 王晓刚;人白细胞介素23基因克隆和携带EGFP腺病毒载体的构建与鉴定[D];大连医科大学;2007年

10 陈童;构建降钙素基因相关肽的穿梭载体[D];浙江大学;2007年

本文编号：2569100