中华按蚊和雷氏按蚊的微卫星DNA库构建及多态位点的筛选

发布时间：2020-01-26 01:26

【摘要】： 中华按蚊(Anopheles sinensis)和雷氏按蚊(An. lesteri)(原嗜人按蚊An. anthropophagus)是我国分布广且常见的蚊种,是其分布区疟疾的重要传播媒介,实施有效的蚊媒防制手段是疟疾控制的重要环节,而蚊媒的生物学特性是制定防制策略的基础。本研究拟构建中华按蚊和嗜人按蚊的微卫星DNA库,并筛选其中多态的微卫星位点,其微卫星DNA序列库可为按蚊基因组学研究积累基础资料;多态的微卫星DNA位点将为中华按蚊和雷氏按蚊的基因定位、群体遗传结构和生态学等领域的研究提供新的分子标志。本研究应用基因组DNA的酶切片段与生物素标记的(AAT)17,(GA)25,(CCT)17,(AC)25,(CAG)17,(CA)18,(CAC)5,(TC)10,(GT)8和(TG)18等寡核苷酸探针杂交,结合亲合素富集和超滤离心浓缩,首先将基因组DNA中含微卫星DNA的片段富集,经3次PCR扩增放大后,插入T载体,转化大肠杆菌(E. coli),筛选含微卫星DNA序列的阳性克隆,测定分析其序列,完成中华按蚊和雷氏按蚊微卫星DNA库的构建。在构建中华按蚊微卫星DNA库的基础上,挑选合适的微卫星位点,设计、合成引物,建立各微卫星位点的PCR扩增体系。应用经分子鉴别的中华按蚊现场样本,聚丙烯酰氨凝胶电泳和基因扫描筛选具有多态性的微卫星位点。本研究获得的结果如下: 1.构建的中华按蚊微卫星DNA序列库中包含282条序列,其中9条序列完全相同,故独立的微卫星DNA序列共273条。 2.本研究的中华按蚊微卫星DNA序列库中双核苷酸重复最为常见,三核苷酸重复次之,多核苷酸重复少见,其中以(CA)n和(GT)n的微卫星DNA序列含量最为丰富,重复次数最多的可达54次。其中完整的微卫星DNA序列89个,占32.6%;非完整的序列82个,占30.1%;其余为复合序列,占37.3%。 3.笔者在构建的中华按蚊微卫星DNA库中,选取了22条适当的序列,设计、合成引物,建立了PCR扩增体系,结果显示其中15对引物有特异扩增条带。 4.经过对现场样本的分子鉴别,选用确认的中华按蚊4个群体的40个样本,PCR扩增各微卫星位点,检测结果显示有10个微卫星位点存在多态性,即:AS5,AS6,AS9,AS13,AS14,AS15,AS16,AS22,AS31和AS43。 5.本研究分离获得61条雷氏按蚊的微卫星DNA序列,其中独立的序列共60条。
【图文】：

酶切图,中华按蚊,基因组DNA,序列分析方法

第二军医大学硕士学位论文司，四色荧光标记的双脱氧链终止法测序，常用 T 载体上通用引物（如：M13+）。2．12 序列分析方法测序结果以 Chromas 软件进行核对，必要时采用 Clustal X 进行源性和差异性采用 Bioedit 和 Mega 软件整理和分析。3 结果与讨论3．1 酶切基因组 DNA、胶回收酶切片段M1 - 1 2 3 M2

中华按蚊,富集,基因组DNA,片段

图 1－2 中华按蚊基因组 DNA 酶切片段连接产物 P泳道 1－4：连接产物的 PCR 产物；M：DN连接有 SAU 接头的胶回收 DNA 片段作为 PCR 反应模物进行 PCR 扩增，，扩增产物片段应集中在 200 - 900 b与酶切基因组 DNA 后收集的的片段应大小一致，提示效的。3 PCR 富集微卫星 DNA
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R384

【参考文献】