抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

发布时间：2020-01-29 13:36

【摘要】：目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。
【图文】：

中国生物制品学杂志2014年12月第27卷第12期ChinJBiologicalsDecember2014，Vol.27No.12本实验应用二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）筛选系统构建稳定表达抗hTNF-α人源单抗的CHO细胞株，并对抗体纯化后进行初步鉴定。1材料与方法1.1细胞及质粒CHO-DG44细胞购自美国Invitrogen公司；L929细胞和含编码抗hTNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒pHL（图1）为北京生物制品研究所有限责任公司第三研究室保存。图1质粒pHL图谱Fig1.MapofplasmidpHL1.2主要试剂及仪器CDFORTICHOMedium、HTmediasupplement和LipofectamineTM2000均购自美国Invitrogen公司；PvuⅠ内切酶购自美国NEB公司；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、放线菌素D和MTT均购自美国Sigma公司；重组TNF-α购自北京义翘神州生物技术有限公司；MabSelectSuRe和Captoadhere层析柱、HBS-EP、乙醇胺、CM5传感芯片和BIAcore3000系统均购自美国GEHealthcare公司；HPLC系统购自日本岛津公司；色谱柱Protein-Pak300SW购自美国WATERS公司。1.3抗hTNF-α人源单抗CHO表达细胞株的构建将CHO-DG44细胞按3×105个／ml的密度接种于125ml三角瓶中，将经内切酶PvuⅠ线性化的质粒pHL（30μg）与脂质体LipofectamineTM2000混合，加入细胞培养液中，用含HTmediasupplement的CDFORTICHO培养基，于37℃，8％CO2，130r／min悬浮培养48h；再用CDFORTICHO培养基（不含HT）进行选择性培养，MTX加压筛选，有限稀释法挑选单克隆，获得分泌表达抗hTNF-α人源单抗的CHO细胞株。1.4抗hTNF-α人源单抗的表达和纯化将抗hTNF-α人源单抗稳定表达细胞株按3×105个／ml的密度接种于1L三角瓶中，，用CDFORTICHO培养基，于37℃，8％CO2，130r／

第27卷第12期ChinJBiologicalsDecember2014，Vol.27No.12和Captoadhere层析两步纯化抗体，获得较纯的抗hTNF-α人源单抗，见图3～5。2.2抗hTNF-α人源单抗的纯度2.2.1SDS-PAGE分析纯化的抗hTNF-α人源单抗经12%SDS-PAGE分析，可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带，见图6。图2表达抗hTNF-α人源单抗的CHO细胞株的生长曲线Fig2.GrowthcurveofCHOcellsexpressinghumanmono－clonalantibodyagainsthTNF-α图3MabSelectSuRe层析结果Fig3.MabSelectSuRechromatogramofhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-α图4Captoadhere层析结果Fig4.CaptoadherechromatogramofhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-αM：蛋白质marker；1：培养上清；2：亲和流穿；3，4：亲和洗脱；5：adhere流穿。图5纯化各步样品的还原SDS-PAGE分析Fig5.ReducedSDS-PAGEprofileofsamplesatvariousstepsofpurificationM：蛋白质marker；1：还原；2：非还原。图6纯化的抗hTNF-α人源单抗的SDS-PAGE分析Fig6.SDS-PAGEprofileofpurifiedhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-α2.2.2SEC-HPLC分析经测定，抗hTNF-α人源单抗的SEC-HPLC纯度为98.79%，见图7。图7纯化的抗hTNF-α人源单抗的SEC-HPLC分析Fig7.SEC-HPLCprofileofpurifiedhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-α2.3抗hTNF-α人源单抗的N-末端氨基酸序列测序结果显示，抗hTNF-α人源单抗的轻链N-末端序列为DIQMTQSPSSLSASV，重链N-末端序列为EVQLVESGGGLVQPG，与预期轻、重链N-末端氨基酸序列一致。表明抗体完全表达，且信号肽剪切正确。02468101214时间（d）020406080100120细胞活率（%）活细胞数（×106）01234567

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