病毒PAMP诱导肝细胞表达IFN-β信号转导途径的研究

发布时间：2020-02-08 17:07

【摘要】： 固有性免疫应答在机体抗病毒感染中起着重要的作用，表达在免疫细胞的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)通过识别病原体的保守分子结构即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，启动一系列信号转导途径诱导保护性细胞因子如Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)和前炎症细胞因子的表达，发挥直接抑制病毒复制的作用，并调节适应性免疫应答。Toll-样受体(Toll-like receptor，TLR)是PRR的一种，与抗病毒作用有关的TLR包括TLR3、7、9，如TLR3能识别存在于病毒基因组或病毒复制时产生的dsRNA，TLR7和TLR8能识别富含GU序列的ssRNA病毒，TLR9则识别病毒基因的CpG-ODN。除TLR外，存在于细胞浆中的RNA解旋酶如视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)和黑素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)也能识别dsRNA，并诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)和前炎症细胞因子的表达。 HBV和HCV常引起持续感染并导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。IFN-α／β在抗慢性病毒感染中发挥重要作用，研究表明HBV和HCV可通过不同的机制抑制IFN-α／β的诱导或拮抗IFN-α／β的生物学活性，可能与HBV和HCV持续感染有关。HBV的核心蛋白抑制IFN-β的转录，HCV的NS3／4A蛋白阻断仙台病毒诱导的IRF-3的活化，从而阻断IFN-β的表达。然而迄今HBV和HCV感染诱导肝脏局部产生IFN-α／β的机制尚不清楚。 目的： 本研究通过RT-PCR方法以及定量PCR方法检测人正常肝细胞株L02细胞、肝癌细胞株SMMC7721和HepG2细胞与抗病毒固有性免疫应答有关的受体表达以及不同PAMP刺激诱导细胞表达IFN-β的情况，以了解肝细胞对病毒PAMP的固有性免疫应答特性，研究肝细胞内的固有性抗病毒免疫途径，为阐明HBV、HCV慢性感染发生机制提供理论基础，同时为研究慢性病毒性肝炎的治疗提供新的策略。 方法： 1．肝细胞表面固有性免疫识别受体及信号转导蛋白的检测：设计和合成TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、RIG-I、MDA5、MyD88及TRIF特异性引物，采用RT-PCR方法检测L02、SMMC7721和HepG2细胞是否表达相应的受体或蛋白。 2．肝细胞对不同病毒PAMP刺激的反应性：取对数生长期细胞，ployI：C以0μg／ml、25μg／ml、50μg／ml直接或用以0μg／ml、2.5μg／ml、5μg／ml转染，刺激细胞6h；polyU以0μg／ml、1μg／ml、2μg／ml转染，刺激细胞24h；CpG-ODN以0μg／ml、10μg／ml、20μg／ml刺激细胞36h。每组2孔。刺激后提取细胞总RNA并逆转录为cDNA，荧光定量PCR检测IFN-β的表达。 结果： 1．人肝细胞固有性免疫识别受体及其信号转导蛋白的表达：L02细胞表达TLR3、TLR7、TLR9、MDA5、MyD88和TRIF，SMMC7721表达TLR3、TLR7、TLR9、MDA5和MyD88，HepG2表达TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、MDA5和MyD88。 2．PAMP刺激肝细胞后IFN-β的表达： (1)polyI：C刺激组：除高剂量(50μg／ml)刺激HepG2组外，经polyI：C刺激后，L02、SMMC7721、HepG2细胞IFN-β的表达显著增高(P＜0.05)，不同剂量组之间无显著性差异(P＞0.05)。 (2)polyI：C转染组：polyI：C转染细胞后，与对照组相比，，L02细胞中IFN-β的表达水平显著增高(P＜0.05)，不同刺激浓度之间无显著差异(P＞0.05)；SMMC7721和HepG2细胞中IFN-β的表达无显著差异(P＞0.05)。 (3)polyU转染组：polyu转染细胞后，与对照组相比，L02细胞中KEN-β的表达水平无显著增高(P＞0.05)，SMMC7721中IFN-β的表达显著增高(P＜0.05)，且与刺激剂量有关(P＜0.05)，HepG2细胞中IFN-β的表达无显著差异(P＞0.05)。 (4)CpG-ODN刺激组：CpG-ODN以高剂量(20μg／ml)刺激后，L02细胞中IFS-β的表达显著增高(P＜0.05)，且与低剂量(10μg／ml)相比也显著增高(P＜0.05)，SMMC7721和HepG2中IFN-β的表达无明显差异(P＞0.05)。 结论： 人肝细胞表达固有性免疫识别受体如TLR3、TLR7、TLR9、MDA5以及信号转导蛋白如MyD88、TRIF。不同的PAMP如polyI：C、polyU以及CpG-ODN可通过相应的受体诱导不同的肝细胞株表达IFN-β，提示正常肝细胞可能在抗病毒固有性免疫应答中起着重要的作用，进一步研究肝细胞抗HBV、HCV感染固有性免疫应答特性以及HBV／HCV的调节作用，有利于阐明HBV、HCV慢性感染的发生机制，并为慢性病毒性肝炎提供新的治疗策略。
【图文】：

图IL02细胞、SMMC7721细胞、HepGZ细胞表达TLR3、TLR7、TLRS、RIG一I、MDAS、MyD88及TRIFmRNA的Rl)PCR分析。Fig.IR不PCRanalysisoftheexPressionofTLR3/TLR7/TLRS/TLRg//MDAS/MyD88/TRIFmRNAinL02eell、SMMC772lcell、HePGZeell.

foyt:C直接刺激肝细胞诱导IF’N一p表达的RT一PcR分析。RT一PCRanalysisfortheexPressionofIFN一pinvarioushePattedbyPloyl:C.2，3:Polyl:CO林g/mlLane4，5，6:Polyl:C25林g/ml8，9:Polyl:C50林g/ml2l
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘靖华,赵克森;TLR与天然免疫反应[J];免疫学杂志;2001年S1期

2 牛海刚;LPS-CD14-TLR传导通路的研究进展[J];山西医科大学学报;2004年01期

3 崔澄 ,王赞旭;固有性免疫刺激因子可用于朊病毒接触后疾病预防[J];国外医学.免疫学分册;2004年01期

4 杨清武;Toll-like receptors研究进展[J];国外医学.生理.病理科学与临床分册;2001年04期

5 徐大为,陈四平,孙肖红;TLRs研究进展[J];承德医学院学报;2003年03期

6 文海平;周红;;白细胞介素-1受体相关激酶家族与自身免疫性疾病[J];医学研究生学报;2011年01期

7 刘兴,冯文莉,康格非;脂多糖受体的研究进展[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2001年03期

8 彭涛;赵逵;;Toll样受体和核苷酸结合寡聚蛋白2与克罗恩病[J];国际消化病杂志;2007年05期

9 俞碧君;;TLR信号通路在慢性炎症性关节炎中的作用[J];国际免疫学杂志;2007年06期

10 王菲;TLR家族分子信号转导新进展[J];国外医学.免疫学分册;2005年05期

相关会议论文 前6条

1 刘娟;;RHBDD3通过抑制TLR触发的树突状细胞成熟抑制自身免疫性疾病的发生[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年

2 安华章;周俊;赵伟;侯晋;谢云;徐红梅;钱程;于益芝;刘书逊;张燕;曹雪涛;;SHP-1抑制自发性及Toll样受体配体诱导的炎性细胞因子的产生[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

3 伍翔;魏海明;孙lm;田志刚;;TLR信号对人NK细胞的调节作用[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

4 安华章;赵伟;侯晋;张燕;谢云;徐红梅;钱程;周俊;于益芝;刘书逊;冯根生;曹雪涛;;SHP-2抑制TLR信号传导中TRIF依赖的细胞因子的产生[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

5 刘书逊;张婷;李丽;于益芝;曹雪涛;;C1q负向调控IFN-α对单核细胞的活化效应[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

6 毛洁;周韧;毛峥嵘;;慢性淋巴细胞性白血病的相关分子标记[A];中华医学会病理学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前1条

1 本报记者 冯淑娟;儿童专用座椅离孩子们有多远[N];中国汽车报;2002年

相关博士学位论文 前10条

1 张宁;TLR信号通路有关基因与系统性红斑狼疮的相关性研究[D];安徽医科大学;2011年

2 封迎帅;从eHSP释放与TLR信号转导途径探讨艾灸对Hp胃黏膜炎性损伤的干预机制[D];湖南中医药大学;2012年

3 易拓;肿瘤细胞/糖脂类复合物联合TLR配体对小鼠NKT细胞和DC功能的影响[D];复旦大学;2012年

4 董丹;以“肺常不足”立论双表法抗流感病毒感染TLR信号通路时效关系研究[D];辽宁中医药大学;2010年

5 王学红;防治溃疡性结肠炎的益生菌的筛选及其部分机制的研究[D];中南大学;2007年

6 李彩霞;猪苓及猪苓多糖对TLR介导的BCG抗大鼠膀胱癌的免疫调节机制研究[D];广州中医药大学;2010年

7 占贞贞;磷酸酶PHLPP对TLR及RIG-I触发的Ⅰ型干扰素产生的选择性调控作用及机制研究[D];第二军医大学;2010年

8 商涛;Leydig细胞中Toll样受体（TLR）介导的睾丸天然免疫反应[D];北京协和医学院;2011年

9 钱程;Fas信号和TLR信号促进调节性树突状细胞负向调控CD4~+T细胞反应及相关机制研究[D];第二军医大学;2008年

10 荆科;TLR2、4在内毒素血症幼鼠肠损伤的作用机制和谷氨酰胺与肠三叶因子保护机制的研究[D];中国医科大学;2007年

相关硕士学位论文 前10条

1 陈q谇

本文编号：2577560