可溶性干细胞因子的原核表达和纯化

发布时间：2020-02-09 06:27

【摘要】：干细胞因子(stem cell factor, SCF)是人体内重要的细胞因子,研究表明干细胞因子单独或协同多种细胞因子,参与机体多种生理过程,包括调动造血干细胞、祖细胞的增殖和分化、调节肥大细胞的发生和发育、胚胎期及成年后神经系统的生长分化、黑素细胞的存活、分化、移行和增生等,是一种能刺激多种细胞生长发育的多功能细胞因子,具有广阔的应用前景。目前在临床上干细胞因子主要被用于外周血干细胞移植(PBSCT)后,调动外周血干/祖细胞的增殖和分化。但是天然SCF来源有限,难以大规模生产,不能满足临床需要。研究表明,基因重组人SCF(rhSCF)和天然SCF具有相同的生物学活性。本研究的目的是通过克隆可溶性干细胞因子活性部分基因片段,并使其在高效原核表达载体中大量表达,经纯化得到得到高纯度蛋白,为干细胞因子的临床应用的进一步研究打下基础。 用Trizol提取人骨髓细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出人可溶性干细胞因子的活性部分,回收RT-PCR产物,并将其克隆到pMD1 8-T载体中转化道大肠杆菌JM109中,蓝白筛选并酶切鉴定阳性重组质粒后进行测序。将测序正确的克隆片断定向连入原核表达载体pET32a(+),然后转化到大肠杆菌JM109。筛选和鉴定正确地重组菌后,转化到BL21中经IPTG诱导表达,使其表达出SCF融合蛋白。扩大培养后,超声波破碎菌体,分离包涵体并溶于8M尿素,通过Ni~(2+)亲和层析柱进行纯化。 克隆得到的活性部分基因与GeneBank报道的序列完全相同。重组质粒pET-SCF构建正确,在表达宿主菌中表达出了大约37KD大小的融合蛋白。融合蛋白主要存在于包涵体中,收集包涵体并溶于8M尿素后,用Ni~(2+)亲和层析柱对溶解液进行纯化,得到的大部分融合蛋白,纯度达到90%。
【图文】：

对pMD18一T一NSZ重组质粒分别用primerM13一48测序，返回的测序报告表明:克隆得到的SCF基因邮04核昔酸组成，与最初的Gnbenak登录的基因序列相比，序列完全相符。重组子可以用于下一步的实验。见图4。

Fig7DisruPtingcellsofPET32a一SCFl:ThesPuematnataetfrdisurPtingeellsofPET32a一SCF2:DPeositionatferdisurPtingofPET32a一SCF3，5，7:ThesPuematnatatferabstersionofinelusionbodies4，6，，8:DePositionatferbastersionofnielusionbodies和层析:S一PAGE电泳显示在Bueff3r洗脱液中有符合分子量大7、8、9道为收集的缓冲液3(咪哇somM)、缓冲液3(哇15omM)、缓冲液3(咪哇200血M)、缓冲液3(咪啤2有杂蛋白出现，是因为非特异性结合而造成的，可能冲液1洗脱的量不够和速度过快造成。9道为缓冲液3软件分析蛋白含量约为90%。穿透收集液中几乎不良好(图8)
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R346

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 冯小黎;重组包涵体蛋白质的折叠复性[J];生物化学与生物物理进展;2001年04期

2 宁云山,李妍,王小宁;包含体蛋白质的复性研究进展[J];生物技术通讯;2001年03期

本文编号：2577729