逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Hela细胞Pokemon基因表达的研究

发布时间：2020-02-24 22:44

【摘要】： Pokemon分子在人类肿瘤如T、B细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等疾病的肿瘤中异常高表达,被直接证明是肿瘤发生的一个关键因素。POK蛋白家族成员在胚胎发育分化和致瘤中也发挥着至关重要的作用。Pokemon (POK细胞髓样发生因子,亦称为LRF, OCZF和FBI-1 )是POK蛋白家族成员,由Zbtb7基因编码,在细胞分化中作用居多并且自身能够影响其它的POK家族成员。缺失Zbtb7基因的小鼠胚胎成纤维细胞对其它原癌基因(如E1A、Ras、Myc和T-Ag等)介导的细胞转化完全无反应;在转基因小鼠模型中Pokemon的过表达导致了肿瘤的发生,并且证明了它是通过直接结合而特异地抑制肿瘤抑制基因ARF的转录。Pokemon基因的作用模式为:Pokemon↑↑→ARF↓→MDM2→p53↓→肿瘤发生。因此,以Pokemon基因为靶标的肿瘤基因治疗具有十分重要的意义。为解决靶向沉默Pokemon基因来治疗肿瘤的问题,我们借鉴了近几年来出现的有关RNA干扰(RNA interference, RNAi )的实验研究。RNAi是出现在多种生物体内、进化上高度保守的一种基因保护机制,被称为“基因组的免疫系统”。其基本作用途径为:长dsRNA被具有RNaseIII活性的Dicer复合体切割成21-23bp的小双链RNA或称为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA的负链与其它多种成分组成RISC (RNA- induced silencing complex),最后通过碱基配对的方式触发同源mRNA的特异性降解。现在,siRNA已经成为应用于临床疾病防治研究的有力工具。已经证实,siRNA对HBV、HIV等病毒和前列腺癌、白血病等肿瘤细胞基因都有很好的沉默作用。这些都为本课题研究将RNAi应用到肿瘤的基因治疗领域提供了理论依据。基于此,本研究利用RNAi技术对Pokemon基因表达进行抑制以达到治疗肿瘤的目的,进行了以下研究: 1、针对Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定 (1)设计针对Pokemon基因的靶序列:利用美国著名RNA产品公司Ambion提供的网上在线设计工具,记录每个AA的3’-端19个氨基酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点通过BLAST分析,去除同源性的靶序列,选择GC含量在40-55%的靶位点
【图文】：

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化学合成了 4 对互补的寡核苷酸链，将其定向克隆入 pSilencer 5.1-H1 Retro 载体，连接产物转化 E.coli。然后经过酶切鉴定和测序来验证构建是否成功。实验材料及仪器一、实验材料设计的 siRNAs DNA 编码序列由 Takara 公司合成，DNA ligation kit Ver2.0、BamHI和 HindIII 限制性核酸内切酶等均购于 Takara 公司，pSilencerTM5.1-H1 Retro 试剂盒购于 Ambion 公司，该质粒环形图谱如图 1 所示。大肠杆菌感受态 DH5α 为本教研室制备保存株，，DMSO 法制备感受态细菌所需的试剂均为国产试剂，质粒抽提试剂盒为Omega 公司的 E.Z.N.A Plasmid Maxiprep kit (D6922-01)，分子量标准 Marker III 和DL2000 均购于北京天为时代科技有限公司，重组逆转录病毒载体送上海英骏（Invitrogen）生物技术有限公司（原上海博亚生物技术有限公司）测序。

插入片段,测序

图 5-1 psiRNA-1 插入片段的测序结果Figure5-1．Sequencing result of the insert fragment in the psiRNA-1图 5-2 psiRNA-2 插入片段的测序结果Figure5-2．Sequencing result of the insert fragment in the psiRNA-2
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

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